[发明专利]纳米颗粒介导的序列特异性核酸酶的投递

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2009年4月7日提交的美国临时申请61/167,389的权益。

发明背景

可以利用纳米颗粒的独特性质来将DNA投递到细胞中。在所调查的纳米颗粒(例如钨、铝、镍等)中，金纳米颗粒(GNP)趋向为投递DNA的卓越候选物。低细胞毒性和容易用有生物学意义的多种配体官能化使金纳米颗粒成为转化的优先选择。金纳米颗粒的大小范围可以为1.2nm-600nm。通常使用的GNP合成对20-400nm的颗粒生成带负电荷(例如柠檬酸盐包被)的表面，而更小的1-10nm范围的GNP是带正电荷的。质粒DNA(其具有足以部分解开其碱基的柔性)可以暴露于金纳米颗粒。在柠檬酸盐官能化的GNP的情况中，质粒DNA能部分解开。DNA主链上的负电荷足够远，从而使得碱基与金纳米颗粒间的范德华引力引起质粒DNA的附着，并包被金颗粒的表面。而在带正电荷的GNP的情况中，静电力和范德华力可以促成DNA的包被或附着。

在金属纳米颗粒外，还已经使用大小范围在3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如量子点)(“QD”)作为载体来将分子投递到细胞中。DNA和蛋白质可以包被或连接到用配体多官能化的QD表面(参见，例如Patolsky，F.等，J.Am.Chem.Soc.125，13918(2003))。可以通过使用标准的生物缀合方案(参见例如Pinaud，F.，D.King，H.-P.Moore，S.Weiss，J.Am.Chem.Soc.126，6115(2004)；Bruchez，M..，M.Moronne，P.Gin，S.Weiss，A.P.Alivisatos，Science 281，2013(1998))来将经羧酸或胺多官能化的QD与含有硫醇基团(参见例如Dubertret B等，Science 298，1759(2002)；Akerman，M.E.，W.C.W.Chan，P.Laakkonen，S.N.Bhatia，E.Ruoslahti，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，12617(2002)；Mitchell，G.P.，C.A.Mirkin，R.L.Letsinger，J.Am.Chem.Soc.121，8122(1999))或N-羟基琥珀酰亚氨基(NHS)酯基团的分子交联。一种备选的方式是经由与链霉亲合素的缀合来多官能化QD。链霉亲合素与生物素化的蛋白质、寡聚物或抗体缀合(参见例如Dahan M.等，Science 302，442(2003)；Pinaud，F.，D.King，H.-P.Moore，S.Weiss，J.Am.Chem.Soc.126，6115(2004)；Dahan M.等，Science 302，442(2003)；Wu.X.Y.等，Nature Biotechnol.21，41(2003)；Jaiswal，J.K.，H.Mattoussi，J.M.Mauro，S.M.Simon，Nature Biotechnol.21，47(2003)；及Mansson，A.等，Biochern.Biophys.Res.Commun.314，529(2004)。

已经使用纳米颗粒来将质粒DNA投递到多种动物细胞。已经发现了，在将经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收该纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的任何基因。在期望对通常具有细胞壁的细胞进行的纳米颗粒投递的情况中，在将所述颗粒添加至原生质体前将细胞壁剥离(参见Torney，F.等，Nature Nanotechnol.2，(2007)。在植物细胞中，细胞壁充当投递外源应用的分子的屏障。已经采用许多侵入性方法，如基因枪(生物射弹)、显微注射、电穿孔、和土壤杆菌(Agrobacterium)来实现将基因和小分子投递至这些有壁的植物细胞中。将小分子和蛋白质投递穿过细胞壁并进入植物细胞中对于开发使得体外和体内操作完整植物的细胞、组织、和器官能够进行的技术会是有利的。