[发明专利]一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断方法，具体是用连接引物构建融合基因并进行原核表达，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。

背景技术

梅毒螺旋体(Treponema pallidum)感染引起的梅毒(syphilis)是最为重要的人类性传播性疾病(sexual transmission diseases，STD)之一。梅毒潜伏期较长、病情进展相对缓慢、加之病灶中分离梅毒螺旋体的阳性率较低，因而检测梅毒螺旋体特异性抗体的血清学试验成为临床上梅毒病的实验室诊断方法。例如，TRUST(梅毒甲苯胺红不加热血清试验)和TPHA(梅毒螺旋体抗体血凝试验)分别是目前普遍应用于临床的梅毒病初筛和确诊试验。

有文献报道，早期梅毒患者血清中存在梅毒螺旋体TpN30、TpN33和TpN37等抗体，但在中、晚期梅毒或治疗后患者血清中，此等抗体水平往往明显下降甚至消失；在早、中期梅毒患者血清中，可检测出TpN15、TpN17、TpN34和TpN47等抗体。由于TpN15、TpN17和TpN47抗体水平较高且稳定、维持时间较长，故被认为是最有临床应用前景的梅毒螺旋体TpNs抗原。

由于至今尚不能用无生命的人工培养基培养梅毒螺旋体，因而建立基于重组TpNs(recombinant TpNs，rTpNs)抗原的梅毒血清学检测方法倍受人们重视。目前以单一rTpNs为抗原所建立血清抗体检测方法已有不少研究报道，但单一重组抗原的灵敏度和特异性较低。为了提高基于rTpNs抗原的梅毒血清学检测方法的敏感性和特异性，我们构建了梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47融合基因tpN15-17-47原核表达系统，建立了基于rTpN15-17-47重组蛋白为包被抗原的ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay；酶联免疫吸附试验)，为临床梅毒病提供了一种快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。

发明内容

本发明的目的是克服非梅毒抗原试验敏感性和特异性较低，梅毒血清学试验中梅毒抗原试验虽有较高敏感性和特异性，但是需制备大量梅毒抗原导致成本较高的缺点；提供一种廉价、快速、敏感和特异的梅毒血清学筛查或诊断新方法。

本发明提供的技术方案是：一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，依次包括以下步骤：采用基因工程技术构建tpN15、tpN17和tpN47的人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统E.coliBL21DE3^{pET42a-tpN15-17-47}，提纯重组表达产物rTpN15-17-47为包被抗原，建立用于检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA。

所述的人工融合基因tpN15-17-47具有序列表5所示的核苷酸序列和氨基酸序列。

所述的一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法，具体包含以下步骤：

1)梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆和测序；

2)人工融合基因tpN15-17-47及其原核表达系统构建和测序；

3)含IPTG的LB培养基中诱导重组蛋白抗原分子rTpN15-17-47表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定重组表达产物rTpN15-17-47的表达情况和产量；

4)Ni-NTA亲和层析法提纯重组表达产物rTpN15-17-47；

5)rTpN15-17-47作为包被抗原的ELISA的建立。

所述梅毒螺旋体tpN15、tpN17和tpN47基因的克隆方法分别是：