[发明专利]一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法

说明书

技术领域

本发明是对传统病毒性疫苗纯化工艺的改进，提供一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法，可用于多种病毒的纯化处理，属于生物技术领域。

背景技术

病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提纯出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是开发高质量疫苗的前提条件，另外病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质--DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。一种好的病毒抗原纯化工艺可以有效去除病毒培养过程中所带来的杂蛋白、宿主细胞DNA、内毒素、及其它杂质，并且具有很好的病毒抗原回收率及纯度。

   传统的病毒类疫苗纯化采用蔗糖密度梯度超速离心纯化工艺，该工艺需要大型离心设备，价格高，上样量少，花费时间长，去除宿主细胞DNA效果也不理想，不适合疫苗产业化的要求；亲和层析方法虽然分离蛋白纯度高，但其对分离条件较严格，相对处理能力低，特别是由于易在表层形成蛋白胶质层，阻碍后期样品渗透，同样不适合大规模生产需要。

   采用常规的凝胶过滤层析虽然其条件温和、重复性好、便于产业化，在疫苗纯化工艺中被广泛采用，但去除杂蛋白和DNA效果并不明显，所以在疫苗制备纯化工艺中只能作为辅助手段。

离子交换柱层析去除宿主细胞DNA效果较为理想，但其去除杂蛋白效果没有疏水层析效果好。其工作机理主要是利用病毒、杂蛋白和DNA的等电点不同，通过改变缓冲液浓度的办法，收集病毒，其操作简单，对病毒作用温和，可反复上样，上样量大，适合疫苗产业化的要求

目前国内对于Vero细胞等传代细胞的宿主残余细胞DNA，严格限制在每剂小于100pg，远远小于WHO和欧盟药典标准即小于10ng水平，因此应用传统的疫苗工艺很难达到我们国家药典标准，因此，需要对疫苗纯化工艺进行创新研究。

    目前除重组疫苗以外尚无文献报道使用疏水层析方法纯化传统病毒性疫苗。

发明内容

本发明提供了一种病毒性疫苗大规模生产的纯化方法，克服了传统疫苗现有纯化技术的缺陷，具有纯化效果好、重复性好、便于疫苗产业化的特点。

本发明病毒性疫苗纯化方法的技术方案，包括下面步骤：

1）采用细胞培养技术收获的病毒抗原；

2）取Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(Low Sub)疏水层析介质，按与水例为4：1，充分搅拌后装填于层析柱中；

3）用0.1-0.5M NaOH溶液，冲洗层析柱，至液体流出为PH8~14，保存1-24小时；

4）用注射用水冲洗层析柱至中性为止；

5）用10-40%硫酸铵，0.01-0.05MPB缓冲液平衡层析柱1-4个体积；

6）将疫苗稀释成含10-40%硫酸铵的浓度，与平衡液硫酸铵浓度一致，上样；

7）上样后继续用平衡液冲洗至基线；

8）用PB缓冲液、注射用水或0.01-0.2MTris-HCL洗脱收集疫苗抗原；

9）收集的洗脱峰样品用凝胶层析或超滤除盐，并进行相应指标测定。

所述病毒抗原为一种有包膜或无包膜病毒：如甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、乙型流感病毒、H5N1流感病毒、肾综合症出血热病毒、狂犬病病毒、甲型肝炎病毒，可以在灭活之前或灭活后进行纯化。

病毒抗原在纯化前可以用离心、0.45-2.5μm滤芯澄清过滤，然后用100-500KD超滤膜进行浓缩。

本发明的积极效果是：利用疏水层析方法去除宿主细胞DNA和杂蛋白。疏水柱层析采用低吸附疏水层析介质进行纯化，主要是利用病毒在一定硫酸铵浓度下，充分暴露其疏水性，从而使其能够结合在层析柱上，而部分杂蛋白由于疏水性弱，残余宿主细胞DNA不具有疏水性，不能结合，所以流穿出来，这样就可以达到去除杂蛋白及宿主细胞DNA目的，其中杂蛋白去除率在90%以上，宿主细胞残余DNA含量达到500pg左右。本发明提供了一种创新性的病毒性疫苗纯化方法，该方法纯化效果好、重复性好、适宜于规模化疫苗制备。经疏水层析后宿主细胞残余DNA在500pg/ml左右，再辅以离子交换等纯化方法可以达到国家药典标准。

附图说明

图1为甲1型流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；

图2为甲3型流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；

图3为乙型流感宿主细胞残余DNA含量图谱；

图4为H5N1流感疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；

图5为狂犬病疫苗宿主细胞残余DNA含量图谱；