[发明专利]月季RcLEA编码序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在月季中表达的RcLEA（月季胚胎发育后期丰富蛋白，Rosa chinensis late-embryogenesis-abundant protein，RcLEA）蛋白基因的克隆，基因表达模式分析，转基因载体的构建，大肠杆菌的转化，转基因菌株的获得及其非生物胁迫耐性的鉴定。

背景技术

由于“温室效应”现象日益明显，全球气温持续升高，夏季高温已成为制约植物生长和发育的主要环境因子，植物生长发育面临高温逆境的严峻挑战。胚胎发育后期丰富蛋白(LEA)是生物体中广泛存在的一类与渗透调节有关的家族蛋白。研究发现在植物胚胎发育晚期，LEA蛋白表达量十分丰富，而且在环境胁迫如干旱、低温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和NaHCO3等条件下LEA蛋白mRNA也会大量累积，被认为是在胁迫过程中对植物起保护作用的物质之一。LEA蛋白在细胞中分布广泛，具有很高的亲水性和热稳定性，即使在煮沸条件下也能保持水溶状态，起稳定细胞膜、分子屏障、离子结合和防止氧化等作用。

在没有胁迫或激素处理的条件下，拟南芥中的一些LEA基因表现出组成型表达特性；在干旱、冷和盐胁迫条件下，部分LEA基因可被胁迫强烈诱导表达。月季RcLEA基因为热激诱导表达，但在高温胁迫条件下，RcLEA只在耐热月季品种中强表达，而在不耐热品种中弱表达甚至不表达，该基因的表达与否与月季品种的田间耐热性差异观察结果相吻合。

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性，自1981 年Dure等在棉花子叶中报告LEA 蛋白以来, 在许多植物的种子、花粉粒和受干旱胁迫的幼苗营养组织中, 发现LEA 蛋白可高水平表达, 且表达水平与植物细胞的抗逆性有着密切的关系. 目前关于LEA蛋白的抗胁迫研究已经积累了一些资料. 如Cheng等将小麦PMA1959 (LEA1 )基因转化水稻, 使转基因水稻的脱水耐盐能力得到增强。利用酵母细胞与植物细胞在一些耐盐反应上的相似性； Swire-Clark将小麦Em 基因(LEA1) 转化酵母, 证明了单一LEA蛋白在提高重组酵母对高浓度NaCl、KCl和低温胁迫的耐受性中起着直接作用。蔡丹等（2006）将大豆Em基因(LEA1) 转化大肠杆菌和烟草, 证明了大豆Em 蛋白的过量表达不仅对提高重组菌耐盐性有着直接的贡献, 也可提高转基因烟草对高盐胁迫的耐受性. 这一结果与前人在水稻和酵母中得到的结果一致, 为前人提出的假说, 即“LEA蛋白在原核生物和真核细胞中可能采取相似的抗逆保护机制”提供了实验证据, 也表明大肠杆菌异源表达体系是研究LEA蛋白耐盐机制的简单、快捷、有效的体系.。

随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物对温度逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。

本发明研究了一种从月季中克隆的胚胎发育后期丰富蛋白基因，转入大肠杆菌后提高转基因菌株对高温、低温及其它非生物胁迫耐性的技术，应用该技术不仅可以提高原核生物的温度抗性，而且预期可以提高转基因植物的温度抗性。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本发明申请中提及的月季RcLEA序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的月季基因RcLEA(SEQ ID NO.1)，该基因是一个胚胎发育后期丰富蛋白基因。

本发明的第二目的是提供这种月季胚胎发育后期丰富蛋白RcLEA编码序列在利用转基因技术提高大肠杆菌对多种非生物胁迫耐受性的应用。

本发明一方面从月季分离出了一种DNA分子，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。它是一种胚胎发育后期丰富蛋白基因，该基因长度为981bp。

本发明另一方面得到了一种蛋白质分子，它编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽，由326个氨基酸残基组成，分子量为36068.98道尔顿，pI为4.526。

本发明还提供了一种检测RcLEAmRNA表达模式的方法，其步骤如下：

（1）耐热性能差异显著的两个月季品种二年生嫁接苗于25℃常温及38℃热激处理2.5—3.5小时，分别提取它们嫩叶的总RNA(植物RNAout试剂盒，市售)。

（2）利用反转录试剂盒（市售）将总RNA逆转录成cDNA，然后根据RcLEA的开放读框的第1-20，962-981的特异序列设计引物，进行PCR。