[发明专利]一株高产L-脯氨酸短波单胞杆菌(JNPP-1)的筛选及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产L-脯氨酸的缺陷短波单胞杆菌(Brevundimonas sp.)JNPP-1的筛选及应用。

背景技术

L-脯氨酸在医药、农业、化工及食品等方面有着广泛的用途，在医药上主要作为氨基酸类药，是复方氨基酸大输液原料之一，用于营养不良、蛋白质缺乏症、严重肠胃道疾患、烫伤及外科手术后的蛋白质补充。也是制备巯甲丙脯酸(Captopril)——治疗顽固性高血压和充血性心力衰竭的药物原料。在合成工业上，L-脯氨酸可参与诱导不对称反应，可作为氢化、聚合、水介等反应的催化剂，具有活性强、立体专一性好等特点；由于L-脯氨酸具有一定的甜味，近几年来国外已开始将其应用于食品工业上作添加剂。目前，主要采用化学法、天然蛋白质水解法和微生物发酵法生产L-脯氨酸。由于化学合成法工艺路线较长，难以投产；而从天然蛋白质水解液中提取L-脯氨酸，其成本高，不适于现代化工业大生产；直接发酵法成为生产L-脯氨酸的主要途径。  利用葡萄糖发酵生产L-脯氨酸的微生物包括谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、链形冠氏杆菌、嗜乙酸棒状菌等细菌，由于L-脯氨酸是代谢过程中的中间代谢产物，不易积累，而且发酵过程中产生的杂酸较多，直接成为L-脯氨酸工业生产中的瓶颈。因此，筛选一株高产L-脯氨酸的微生物具有非常重要的意义；而关于缺陷短波单胞杆菌生产L-脯氨酸的研究并未见国内文献报道。

发明内容

(要解决的问题)

本发明的目的在于针对现有L-脯氨酸的生产方法中的技术难点及存在的问题，提供一株新型的高产L-脯氨酸的缺陷短波单胞杆菌，利用该菌株发酵可生产高浓度的L-脯氨酸，该菌株是极具有开发研究价值的L-脯氨酸的生产菌株。

发明内容

本发明的发明人从国内化工厂取得土样分离筛选获得一株产L-脯氨酸新型缺陷短波单胞杆菌JNPP-1，并对这株菌进行了发酵研究。

本发明提供的菌株是从国内化工厂取得土样分离筛选获得一株短杆菌，根据形态特征和生理生化特性，将其鉴定为Brevundimonas sp.，编号为JNPP-1。该菌于2010年5月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3828。

本发明提供的缺陷短波单胞杆菌JNPP-1的形态特征与生理生化特征为：

该菌株形态为短杆状，在LB固体培养基上菌落圆形、表面光滑、菌苔湿润、不透明、颜色灰白色；单个、成对或短链状排列，单侧鞭毛，无芽孢。氧化酶反应呈阳性，V.P.反应呈阴性，可利用葡萄糖、麦芽糖；不能利用阿拉伯糖、木糖、蔗糖、柠檬酸盐产酸，不能水解淀粉、酪蛋白、明胶，可以利用尿素、无机碳源。生理生化特征见表1：

表1

本发明提供的缺陷短波单胞杆菌JNPP-1是具有良好前景的产L-脯氨酸的新型生产菌株，该菌株可在高渗肉汤培养基中生长。高渗肉汤培养基配方为：葡萄糖20-50g/L；蛋白胨5-20g/L；酵母粉4-10g/L；NaC1 5-20g/L；氯化铵50-100g/L；琼脂粉10-20g/L；补充蒸馏水至1L，灭菌前调培养基的pH至7.0-7.4，在115℃高压蒸汽下灭菌20min；

上述的缺陷短波单胞杆菌JNPP-1可以采用发酵法生产L-脯氨酸。

应用上述微生物生产L-脯氨酸的方法，其步骤如下：

1)采用保藏号为CGMCC No.3828的缺陷短波单胞杆菌JNPP-1为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到肉汤固体培养基上；

2)制备的缺陷短波单胞杆菌JNPP-1菌株的细胞液体培养物：挑取步骤(1)的肉汤固体培养基上的JNPP-1菌株一环，接种于装有20-60mL培养基的250mL锥形瓶中，培养温度为30-40℃，置摇床上以90-200r/min的转速培养9-12h至对数生长中期，即得到JNPP-1菌株的细胞液体培养物；