[发明专利]一种骨骼肌特异性CKM启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子及其在转基因猪中的应用。

背景技术

真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。某些特定基因表达的调节由转录因子特异性结合于调控区相关元件，成为转录起始的关键步骤，并最终导致基因的时间和空间表达。编码组织特异蛋白的基因严格按照组织特异性和发育阶段性表达，为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。在特异高效表达的转基因动物中，获得能广泛应用的特异性启动子非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制，在不同种类和不同发育时期起关键作用的调控元件并不相同，调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达，必须构建一个可以特异高效表达的动物表达载体，其中启动子的选择是重要的条件之一。

肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型、脑型、杂化型和线粒体型。其中肌肉型(Creatine Kinase Muscle，CKM)主要存在于骨骼肌细胞中，猪CKM基因包含八个外显子和七个内含子，编码381个氨基酸。该基因5′调控区包含多个MyoD结合位点，转录起始位点上游-60bp包含一个CAAT Box，-33bp包含一个TATA Box。通过克隆该基因启动子区并在体外分析其启动特性，利用相关序列构建骨骼肌特异性表达载体是一种有效的方法。但是上述的研究均还处在起步阶段，对于转基因猪的培育和提高肉品品质提高均没有起到较好的促进作用。

发明内容

基于上述的原因，本发明的发明人经过研究发现猪肌酸激酶基因5′调控区具有骨骼肌特异性启动特性，并利用这一特性设计了一种骨骼肌特异性表达启动子载体，该启动子可以在转基因猪的培育中应用。该启动子载体具有骨骼肌特异性启动特性，而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性，可见该启动子在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，为转基因载体提供了一种重要的元件。

本发明所提供的骨骼肌特异性表达基因5′调控区特异性启动子，其基因序列如Seq IDNo：1所示；

除了上述的启动子之外，还可以是该启动子的变体或者片段，均具有如Seq ID No：1所示的基因序列。

“变体”是指对猪CKM启动子Seq ID No：1序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于Seq ID No：1序列的活性。

“片段”是指基本DNA序列的一个或者多个区域，其仍然类似于猪CKM启动子Seq IDNo：1的活性。

具有上述序列的启动子或其变体，或者片段，具有骨骼肌特异性启动特性，而在骨骼肌之外的多种细胞中均无启动活性，可见该基因启动子在骨骼肌中特异性地启动下游基因的表达，能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求，并能应用于转基因猪的培育中。

应用上述的核酸时，一般采用重组核酸序列，其中含有上述的启动子或其变体，或者片段，这样就可以使于启动子下游的目的基因在骨骼肌中特异性表达，作为分析、开发、改造骨骼肌特性的研究模型。还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目的基因的重组核酸，通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎，用于建立转基因动物。重组核酸序列中的目的基因，含有下列的至少一种功能基因，主要包括提高肌肉品质基因，加快生长速度基因，抗病基因，提高饲料报酬的基因以及生产特定药物的基因，这样就可以在获得骨骼肌特异性启动特性之外，提高该重组核酸序列的性能，为转基因猪的培养提供更多的功能性方向，增加其附加产值，如将去饱和脂肪酸酶基因在该启动子指导下表达可以特异性提高骨骼肌中不饱和脂肪酸的含量，提高肉品营养价值。

在获得了上述的重组核酸序列之后，还可以用其建立特殊的表达系统，以便更好的应用于转基因猪的培育过程中。将目的基因重组至该启动子下游，通过基因转入技术使调控区与目的基因共同整合进染色体中，获得转基因动物，在该启动子作用下目的基因仅在骨骼肌中表达，在其他组织器官中不表达，降低目的基因对动物的影响，提高转基因的效果。