[发明专利]共表达小鼠膜型白细胞介素15和Rae-1ε的转基因细胞及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种共表达小鼠膜型白细胞介素15和小鼠视黄酸早期转录因子1ε（retinoic acid early transcript 1ε，Rae-1ε）基因的转基因细胞及其制备方法。

背景技术

最近发现的一类能够分泌IFN-γ并具有杀伤功能的新型树突状细胞亚群（IFN-γ producing killer dendritic cells，IKDC）兼具NK细胞和树突状细胞（dendritic cells ，DC）的表面标记和功能。已有的研究表明，IKDC直接杀伤肿瘤细胞后，可进一步将肿瘤细胞衍生的肿瘤抗原提呈给T细胞，从而启动抗肿瘤的适应性免疫应答。因此，IKDC在肿瘤的免疫治疗中具有良好的应用前景。目前获取IKDC主要有两种方法，一是直接分选法：取小鼠相应的淋巴组织，制备成单细胞悬液，通过流式细胞仪（FACS）的方法直接分选获得CD11cdimB220⁺NK1.1⁺CD49b⁺的IKDC。但是，IKDC在小鼠体内的含量极少，只占脾脏CD11c⁺细胞的1-2%（约5000个）和骨髓CD11c⁺细胞的2%，用直接分选法获得的IKDC数量远远不能满足过继免疫治疗所需的细胞数。另一种是体外用白细胞介素15（IL-15）扩增IKDC：首先常规培养骨髓来源的DC，然后利用磁珠分选法富集CD49b⁺细胞，再从CD49b⁺细胞中FACS分选出CD11c^dimB220⁺NK1.1⁺的IKDC，最后将IKDC与饲养细胞和重组的IL-15共培养，通过饲养细胞反式提呈IL-15，扩增IKDC，这种体外扩增IKDC的方式不仅操作繁琐，而且饲养细胞反式递呈IL-15只作用于邻近细胞，缺少递呈的靶向性，实验数据也显示对IKDC扩增效率比较低（仅能出现10-30倍的数量增长）。因此，如何体外高效扩增IKDC，成为基于IKDC过继免疫治疗的关键因素。

发明内容

本发明通过Rae-1ε /NKG2D的“搭桥”作用（给肿瘤细胞BaF3转染Rae-1基因），将肿瘤细胞和IKDC紧密连接在一起，同时给肿瘤细胞转染小鼠膜型IL-15（mbIL-15）基因，使肿瘤细胞膜上表达IL-15，从而靶向性反式递呈IL-15，达到高效刺激IKDC增殖的目的。

本发明所采用的技术方案是：首先通过PCR技术克隆小鼠Rae-1ε基因，然后利用重叠PCR技术将小鼠CD8α分子的信号肽序列、小鼠IL-15成熟肽编码序列和CD8α的跨膜区和胞内区的编码序列拼接起来，获得膜表达型IL-15的编码基因（命名为mb15）。将Rae-1ε基因和mb15基因分别插入真核表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点中，构建成重组真核表达载体pV/mb15/RAE-1ε。将pV/mb15/RAE-1ε用脂质体转染法转染BaF3细胞，通过潮霉素筛选以及FACS分选的方法，获得稳定共表达膜型IL-15和Rae-1ε蛋白的BaF3细胞，命名为BaF3/mb15/RAE。

本发明方法制备的转基因细胞具备以下的优点：1. 提高了扩增IKDC的靶向性：该转基因细胞可通过其表面的Rae-1ε靶向性作用于表达活化型受体NKG2D的IKDC。2. 简化体外IKDC扩增的操作步骤：可用该转基因细胞直接扩增常规骨髓来源的DC，然后再通过FACS分选经扩增后的IKDC，不仅操作步骤减少而且富集率高。3. 经济：该转基因细胞表达膜型IL-15，用于扩增IKDC时，不需要购买商品化的重组IL-15。4. 实用性强：该转基因细胞除了可以诱导IKDC的活化和增殖外，也可应用于其他既表达NKG2D，又依赖于IL-15生长的细胞的活化和增殖，如NK细胞。5. 延伸性强：可在已经获得的转基因细胞的基础上，再转入其他的关键分子，如共刺激分子，赋予该转基因细胞新的功能。

附图说明

图1 是重组质粒pV/mb15/RAE-1ε的构建策略。

图2是BaF3/mb15/RAE细胞促进NK细胞高分泌IFN-γ

免疫磁珠法分选脾脏NK细胞与BaF3细胞或BaF3/mb15/RAE 细胞共培养，24小时后收集培养上清。（A）利用CBA技术检测上清中IFN-γ的分泌水平。（B）IFN-γ的分泌量以mean±SD的方式表示，*P<.05。