[发明专利]亨廷顿病相关蛋白polyQ的体外聚集模型的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种亨廷顿病相关蛋白polyQ的体外聚集模型的建立方法。

背景技术

亨廷顿病(Huntington’s Disease，HD)是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病，主要发生在中老年人群，患者的行为能力和认知水平障碍。亨廷顿病是由HD基因突变，即HD基因第一外显子中编码多聚谷氨酰胺的CAG重复序列异常扩增，其表达产物一亨廷顿蛋白(huntingtin，Htt)氨基端的多聚谷氨酰胺(简称“PolyQ”)异常延伸，PolyQ长度超出一定阈值，Q＞35(即Q的数量＞35)，表达产物(Htt蛋白)发生异常聚集，从而对神经元产生毒性而发病。正常的Htt蛋白弥散分布在神经元胞质内。在HD患者和HD动物模型的脑组织(或神经元)内，突变的Htt蛋白聚集成淀粉样斑块或形成包涵体。PolyQ长度与患者发病年龄相关。PolyQ在正常人群中短于35个，而在HD患者中突变Htt的谷氨酞胺长度超过36个(参见：Davies SW，TurmaineM，Cuzens，HA，at al.Formation of neuronal intranuclear inclusionsunderlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HDmutation[J].Cell，1997，90：537-548)。在HD成年患者中约为40～50个，老年患者中则＞55个。已有资料表明，亨廷顿病的发生与亨廷顿蛋白(Htt)内的多聚谷氨酰胺(PolyQ)的长度、多肽的构象变化(形成β片层)、形成的多聚体及其在神经元内形成的淀粉样斑块沉淀有关。

以PolyQ为靶点，构建PolyQ聚集的体外模型筛选和鉴定具有抗polyQ聚集的蛋白(多肽)及小分子化合物，对获得可防止和干预亨廷顿疾病的药物具有重要意义。

据文献报告，硫代黄素T(Thioflavin T，ThT)是一种阳离子苯并噻唑荧光染料，能够和淀粉样蛋白结合并产生增强的荧光。已有学者检测到在组织切片中的ThT可与淀粉样蛋白结合、并产生的荧光强度会增强。在体外实验中，用混合的有机溶剂六氟异丙醇(HFIP)和三氟乙酸(TFA)可溶解人工合成的polyQ的聚集体，使其成为polyQ单体，为在体外研究polyQ多肽的构象及其聚集提供了一个新的途径。Chen等(2002)报道通过Thioflavin T方法在体外检测polyQ的聚集，与经高效液相色谱(HPLC)定量检测的聚集结果一致，说明Thioflavin T在体外检测polyQ的聚集是可行的(参见：Chen S，Berthelier V，Hamilton JB，at al.Amyloid-like features of polyglutamineaggregates and their assembly kinetics.Biochemistry，2002，41：7391-7399)。应当指出的是，在体外研究polyQ的聚集，要人工合成polyQ。这不仅成本较高，不能满足进行高通量筛选的需求。

发明内容

本发明的目的在于针对现在人工合成polyQ所具有的缺点，提供一种用基因工程方法获得polyQ，探索体外聚集的亨廷顿病相关蛋白POLYQ的体外聚集模型的建立方法。

本发明的亨廷顿病相关蛋白polyQ的体外聚集模型的建立方法，包括如下顺序的步骤：

(1)构建GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表达载体：所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白是在polyQ多肽序列的N端加有GST标签，polyQ长度为Q36-Q55，所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表达载体是包含有编码GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白的核苷酸序列的表达载体；

(2)所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表达载体在表达菌BL21star中表达GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白；

(3)将上一步所得表达产物通过亲和层析纯化获得GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白；

(4)将GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白用蛋白酶酶切去除GST标签，获得polyQ多肽，冷冻干燥；