[发明专利]一种百合脱毒籽球的快速培养方法

权利要求书

1.利用生物反应器快速培养百合脱毒种球的方法，按如下步骤进行：

(1)外植体灭菌和生长点的剥取：在35-38℃条件下种植百合种球，经过7-15天的培养，待芽长高并绽开成莲座状，开始采集百合茎尖，用中性肥皂水清洗3-5分钟，自来水冲洗过夜，0.1％升汞灭菌5-10分钟，然后在70％酒精浸泡10-15秒。取出茎尖，先用加吐温灭菌水冲洗2-3分钟，再用灭菌水冲洗5-6遍。外植体清洗干净后，开始剥取生长点，先将茎尖的叶片全部剥除，用解剖针挑取百合茎尖生长点，生长点长度为0.4-0.8(mm)，将剥取的生长点立即接种。

(2)脱毒培养：，步骤①诱导培养，剥取的百合茎尖生长点接种到诱导培养基(1/2MS+6-BA 1.0-2.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4％蔗糖+琼脂粉6g/L(pH 5.8))，经过40-60天培养，生长点膨大成直径2-3(cm)的叶丛。②将叶丛切成0.5(em)小块，接种于含病毒唑的培养基(MS+NAA0.2-0.5mg/L+4％蔗糖+病毒唑(Ribavirin)5-10mg/L+琼脂粉5g/L+0.5％活性炭(pH5.8))，经过40-60天培养，形成带球的瓶苗。

(3)病毒检测：将步骤②瓶苗送到，农业部花卉产品质量监督检验测试中心(昆明)，经检测确认无任何病虫害现象并不带百合无症病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合斑驳病毒(LMoV)等病毒，才确认是百合脱毒种苗。

(4)脱毒籽球诱导培养：经过病毒检测，将步骤②脱毒瓶苗转移到籽球诱导培养基(MS+KT 2-5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+4％蔗糖+琼脂粉5g/L+0.5％活性炭(pH 5.8))，在温度22±1℃，光照强度1500Lx，光照12h/d的环境条件下培养40-60d，直接诱导出脱毒籽球。

(5)增殖培养：将步骤(4)组培籽球，切去叶片和部分基部组织后，纵切成3-4块直径0.3-0.5cm材料，接种于和籽球诱导培养相同的培养基上，在温度22±1℃，光照12h/d，光照强度1000-1500Lx的环境条件下培养2个月，可以扩繁3-4倍。

(6)脱毒籽球在生物反应器内液体培养：将步骤(5)培养的组培籽球分开，形成单个的小籽球，大约直径0.3-0.5cm，然后接种于反应器内。液体培养基(MS+NAA 0.2-0.5mg/L+吡效隆CPPU 1-4mg/L+6％蔗糖(pH 5.8))，在22±1℃、1500Lx和2L/min通气量条件下培养45天，培养籽球直径可达1.0-1.4cm，根系在3-5条/粒，籽球重0.7-1.2g/粒。

(7)冷藏：取出步骤(6)培养的脱毒籽球，用清水冲洗掉培养液，包裹于消毒草炭中，经3-4℃冷藏处理30-40天打破休眠。

(8)移栽驯化：将步骤(7)籽球取出，用2000倍阿米西达药液浸泡籽球20分钟，然后定植到80-90穴的穴签中，穴盘基质：草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌匀装盘。定植后浇透水，并用地膜覆盖穴盘。放到网室内养护，昼温20-25℃，夜温10-15℃，盘土保持湿润，定植成活后，每周喷一次1/2MS营养液。

(9)待籽球直径长到2cm以上，可选择具夏季冷凉气候的800～1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。

2.根据权利要求1所述的方法，其特点在于采用综合脱毒技术，即将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法。

3.根据权利要求1所述的方法，其特点在于培养材料为“西伯利亚”(Siberia)、“索帮”(Sorbonne)、“马可波罗”(Marco polo)、“曼妮莎”(Manissa)、“康伽德奥”(Concad′O)5个品种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特点在于在35-38℃条件下种植百合种球，经过7-15天的培养，待芽长高并绽开成莲座状，开始采集百合茎尖，用中性肥皂水清洗3-5分钟，自来水冲洗过夜，0.1％升汞灭菌5-10分钟，然后在70％酒精浸泡10-15秒。取出茎尖，先用加吐温灭菌水冲洗2-3分钟，再用灭菌水冲洗5-6遍。外植体清洗干净后，开始剥取生长点，先将茎尖的叶片全部剥除，用解剖针挑取百合茎尖生长点，生长点长度为0.4-0.8(mm)，将剥取的生长点立即接种。