[发明专利]一种用于促进胰岛素分泌的基因、其制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种促胰岛素分泌的基因、其制备方法及其应用。 

背景技术

胰岛β细胞内特异性表达的K_ATP通道亚基Kir6.2（或BIR）于1995年被克隆并被证实为一类新的内向整流性的K⁺通道基因家族(Kir6.x) 成员。Kir6.2 基因在脑、胰岛、心脏、骨骼肌等器官组织中都有所表达，但在胰岛β细胞内高丰度表达，是组成K_ATP通道的K⁺通透孔道的重要亚基，同时是调节胰岛素分泌的关键因子。 

胰岛素是包含了51个氨基酸的缩氨酸激素，产生于机体胰岛组织，对机体的代谢有明显的调制作用。在机体内，胰岛素促使肝脏、肌肉和脂肪组织细胞从血液中吸收葡萄糖，并将它们储存为糖原，而取代脂肪作为能量资源。只有当体细胞中不能吸收胰岛素，或吸收的胰岛素很少时，体细胞才利用脂肪作为能量资源。而当体内的胰岛素的释放失控时，常会引发糖尿病、动脉血管的柔韧性障碍和认知障碍等疾病。 

  RNA干扰( RNA interference, RNAi), 是指当细胞中导入与内源性mRNA 编码区同源的双链RNA时, 生物体抑制特异的内源性mRNA表达的一种现象，而且mRNA 发生降解，从而导致特定基因表达沉默。RNA干涉机制在细胞中以RNA分子双链形式出现, 当双链RNA 激活时，可以降低内源性mRNA 分子水平的表达。当靶标mRNA 分子消失时,相应的基因表达沉默。 

目前，尚未见有关用于促进胰岛素分泌的基因的报道。 

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于促胰岛素分泌的基因。 

本发明的目的之二在于提供该基因的制备方法。 

本发明的目的之三在于提供该基因的应用。 

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种用于促进胰岛素分泌的基因，其特征在于该基因为SEQ NO.1所示的碱基序列。

一种制备上述的用于促进胰岛素分泌的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，设计对应于Kir6.2基因574-592位，即GCA TCC ACT CCT TTT CGT C的shRNA的寡核苷酸序列引物，各为53bp，送生工生物工程（上海）有限公司进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列为： 

SEQ NO.1:

Sense： 5’- aca ccg cat cca ctc ctt ttc gtc ttg ctt gaa gac gaa aag gag tgg atg ct-3’

Anti-sense:：5’-aaa aag cat cca ctc ctt ttc gtc ttc aag caa gac gaa aag gag tgg atg cg-3’；

根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit基因质粒构建试剂盒中载体设计的具体要求，将设计的shRNA的寡核苷酸序列引物和P^SilenCircle质粒进行连接，得到用于促进胰岛素分泌的基因。

一种上述的用于促进胰岛素分泌的基因在制备促进胰岛素的分泌药物中的应用。 

本发明设计对与胰岛素分泌有关联的基因的RNAi，并应用胰岛β细胞模型研究其对胰岛素分泌的促进作用。为RNAi在糖尿病的治疗应用提供了一种新方法。 

附图说明

 图1为shRNA的寡核苷酸序列引物和P^SilenCircle质粒的连接图。 

 具体实施方式： 

一、胰岛β细胞的培养：胰岛β细胞HIT-15细胞系培养于37℃，5%CO₂恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养液以易于混匀细胞；用移液器将其移入15ml离心管中，1500rpm离心3min；去上清；用5ml无菌1×PBS将细胞悬起，并吹打混匀；加约1ml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37℃，5%CO₂ 培养箱中培养，约3天左右传代1次（主要查看细胞有无铺满培养瓶）。