[发明专利]具备抗血管生成活性的白蛋白变异体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种蛋白变异体及其制备方法。

背景技术

“血管生成”(angiogenesis)一词于1787年由英国外科医生John Hunter首次提出。由此，人们发现“血管生成”与胚胎发育、组织再生以及慢性炎症有关[1]。直到1971年Folkmani证明“血管生成”与肿瘤生长有关[2]。从此，“抗血管生成”(anti-angiogenesis)成为一种新的抗肿瘤治疗战略。

血管内皮细胞的生长和分化调控是血管生成的关键步骤。已证明前者受酪氨酸蛋白激酶调节。血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体-2(KDR)与VEGF结合，导致其受体酪氨酸蛋白激酶活性被活化，从而启动一系列后续细胞信号传导通路。这一过程对于调控内皮细胞前体分化以及原始血管网络的形成至关重要。因此，抑制KDR的活性是抑制血管生成的关键点之一。[3]

临床实验中，许多小分子化学物质可特异性抑制KDR酪氨酸蛋白激酶活性，从而有显著的抗血管生成效应。然而，临床实验结果证明这些小分子化学物质毒性副作用较大。最近，有人用中和抗体技术阻断KDR的生物学活性，实验证明这些抗体有有效的抗血管生成作用。进一步这些抗体已成功用于临床肿瘤抗血管生成治疗[4]。

由于噬菌体显示技术(phage-display technology)的广泛应用，人们筛选到许多具有生物学活性的多肽[5]，其中一些具有十分有效的药物学效应。然而，由于小肽分子在体内应用的局限性，到目前为止很少有小肽药物的成功上市。但具有药物效应小肽分子的发现，也为进一步药物的设计和改造提供了非常有用的基本信息。现已发现ATWLPPR肽可以抵抗VEGF在体外刺激血管内皮细胞的增殖，并且可在动物体内完全阻断VEGF诱导的血管生成[6]。然而，这一小分子肽在体内半衰期短，用于治疗肿瘤效果有限。

人白蛋白(人血清白蛋白)是血液中最丰富的蛋白质之一，大约浓度为50mg/ml(600μM)，其半衰期约为19天[11，12]。白蛋白对于维持血液的PH，胶体渗透压有着非常重要的作用，同时它也作为体内许多代谢物和脂肪酸的载体。许多药物进入体内也利用白蛋白作为运送载体。最近，有人成功地利用白蛋白结合多肽将小肽药物附着在白蛋白分子上，从而大大提高了小肽药物在体内的半衰期和药物疗效作用[13]。也有人将多肽药物分子直接与白蛋白一起表达成融合蛋白，从而利用白蛋白在体内的特性提高其多肽药物在体内的半衰期以及生物学疗效[14]。但是，直接将白蛋白进行定向化改造使之具有其他的活性还未见报道。

发明内容

本发明要解决的是现有的ATWLPPR肽体内半衰期短，用量大的问题。

解决该问题的技术方案是提供一种白蛋白变异体。该白蛋白变异体为白蛋白C末端的KEQLK肽段突变为WLPPR肽段而得。

其中，所述的白蛋白为人白蛋白。

进一步的，上述白蛋白变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了编码上述的白蛋白变异体的基因。

进一步的，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

同时，本发明提供了含有上述基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

为了制备上述的白蛋白变异体，本发明还提供了一种制备所述白蛋白变异体的方法。该方法包括以下步骤：

a、将白蛋白编码基因序列中编码肽段KEQLK序列的核苷酸序列诱变成编码氨基酸肽段WLPPR序列的核苷酸序列，得到白蛋白变异体编码基因序列；

b、将白蛋白变异体编码基因序列到连接到表达载体中；

c、将表达载体转入宿主中进行表达得到白蛋白变异体。

其中，上述的表达载体优选为真核表达载体，宿主细胞优选为真核宿主细胞。

其中，上述的将白蛋白编码基因序列中编码肽段KEQLK序列的核苷酸序列诱变成编码氨基酸肽段WLPPR序列的核苷酸序列的诱变方式可以使用定点诱变引物进行PCR完成定点诱变。

本发明要解决的另一个技术问题是提供上述的白蛋白变异体或表达载体在制备抗血管生成药物中的用途。同时本发明提供了一种抗血管生成药物，该抗血管生成药物由上述的白蛋白变异体或表达载体添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。