[发明专利]染色体异常的产前诊断方法

说明书

本申请是2004年10月18日申请的中国国家申请号为200480036100.4，国际申请号为PCT/US2004/033175，发明名称为“染色体异常的产前诊断方法”的发明申请的分案申请。 

相关申请的交叉引用

依据美国法典第35章第119(e)条，本申请要求2003年10月8日申请的美国临时申请号60/509,775的权益，该临时申请的内容通过引用全部结合到本文中。 

发明领域

本发明涉及染色体异常的无创性产前诊断方法。本发明的方法可以用来检测染色体DNA缺失和重复。在优选的实施方案中，所述方法用于诊断染色体非整倍性及相关疾病，例如唐氏综合征(Down′sSyndrome)和特纳综合征(Turner′s Syndrome)。本发明还提供鉴定甲基多态性探针的方法，所述甲基多态性探针可用于检测胎儿染色体异常。 

发明背景

染色体异常是造成大量先天缺陷(包括精神发育迟缓)的主要原因。异常一般表现为染色体DNA重复和缺失，以及染色体非整倍性，后者指的是完整的染色体的异常存在或缺失。当生物体具有少于或多于正常二倍体的染色体数量时，就会产生大量异常特征并引起多种综合征。唐氏综合征，亦称21三体综合征，是染色体非整倍性最常见的例子，包括一条额外的21号染色体。其它常见的染色体非整倍性有13三体综合征、18三体综合征、特纳综合征和克兰费尔特 综合征(Klinefelter′s Syndrome)。 

对于染色体异常产前检测的选择主要限于有创性方法，这些方法会有致使胎儿丢去的风险，虽小但的确有一些。最常用的检测异常的方法是羊膜穿刺术。然而，由于羊膜穿刺术是有创性方法，因此通常只用于高龄产妇，因为高龄产妇的胎儿出现染色体异常的风险有所增加。因此，建立用于胎儿染色体异常诊断的无创性方法非常有益，这些方法可以使众多的准妈妈受益。美国专利号4,874,693中已经描述了这样一种无创性方法，该专利公开了通过监测母亲的人绒毛膜促性腺激素(HCG)水平，检测胎盘机能障碍以显示染色体异常的方法。然而，虽然这种方法是无创性的并且能够用来筛选所有年龄段的准妈妈，但它不能作为具体染色体异常存在的诊断方法，也不能作为具体染色体异常存在的保证。 

现有的产前诊断方法除了取样步骤是有创性的，操作也耗时费力。例如，吉姆萨(Geisma)染色法是最广为使用的技术，这种方法要求实验时，细胞处于细胞分裂中期或者正在分裂。每对染色体要染上特征性的明带谱或暗带谱。采用这种方法，所有的染色体能够被一一区分并容易展现任何结构上的或数量上的异常性质。吉姆萨染色法不是总能检测出精细的染色体重排。如果怀疑染色体重排，但用这种方法检测不到，进一步的详细分析可以使用荧光原位杂交(FISH)或图谱核型分析(SKY)进行。用吉姆萨染色法，测试结果需要一到两周。 

SKY就是用不同探针(染料颜色)对每个中期染色体染色的技术。因为每个染色体特异性探针都会发射自身所特有的荧光波长，因此能够容易地观察到结构重排，并能够容易地鉴定所涉及的染色体。由于SKY要求细胞是处于细胞分裂中期的细胞，因此结果需要一到两周。 

FISH就是用荧光探针(染料)与特异性个别染色体或染色体的某些区结合或杂交的技术。受到影响的染色体或染色体区发荧光或是发出信号，可以通过荧光显微镜目测分析它们的存在或缺失。FISH 通常用于鉴定具体的染色体重排或快速诊断出异常染色体存在的数量。对于异常染色体数量，FISH是目前最快的诊断异常染色体数量的方法。速度较快是因为分析用的细胞不必是处于细胞分裂中期的细胞。因此，一般2到3天就可以知道测试结果。 

因此，本领域需要无创性的产前诊断方法，这些方法能够快速而准确地帮助确定染色体畸变的存在和类型。 

发明概述

本发明描述了用于染色体异常例如染色体非整倍性的无创性产前诊断方法，所述方法可以快速地做出准确的结果。本发明方法使用的是得自孕妇的血浆样本。已经显示出，除了母体血浆中有较小百分比的胎儿细胞外，母体样本还含有较小百分比的胎儿DNA。 

常染色体具有一个母亲遗传的等位基因(A，如下表所示)和一个来自父亲的等位基因(B，如下表所示)。有一种情况，其中胎儿DNA占母体血浆样本中存在的总DNA的约2％，胎儿等位基因的存在状况描述如下： 

因此，由于正常与三体之间的B％的差异仅仅是(2/200-2/202)即0.01％，因此这种差异太小了，即便采用现有最好的定量方法也难以发现。