[发明专利]一株提高按树抗冻能力的内生真菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株青霉菌株及其应用，更具体地涉及了一株能提高按树抗冻能力的内生真菌及其应用。

背景技术

桉树同松树、杨树一起被称为世界上三大速生树种，由于其具有广泛的适应性，且经济价值高，同时兼具有生态和社会效益，而受到不少国家的青睐。目前，桉树已经成为我国南方发展速生丰产林的战略树种。但由于桉树的低温抗冻能力比较差，受到区域极端气温的影响，限制了其推广范围。目前研究桉树抗寒能力主要从生理和分子两方面进行研究。生理方面涉及蛋白质、糖、脂类等生物大分子和膜、细胞器等结构的变化，以及光合作用和呼吸作用等生理过程^[1]。分子机理方面主要从事桉树的转基因研究，在桉树转基因研究中涉及了愈伤组织再生、体胚再生、原生质体再生等桉树再生体系的建立，转基因方法只要有农杆菌介导法、基因枪转移法等目前转基因主要方法，转基因过程所可选择的基因主要包含抗冻蛋白基因、冷诱导基因、脂肪酸去饱和酶基因、抗氧化酶活性基因、渗透调节相关基因和LEA蛋白基因^[2~6]。

人们在健康植株中发现内在微生物起始于100多年前，这类微生物被称为内生菌（endophyte）。但由于其存在对植株并无有害症状，因此长期受到忽视。在20世纪30年代由于畜牧业受到了感染真菌的牧草的影响而引起重大损失，植物内生菌的研究才逐步引起重视^[7]。植物内生菌几乎存在于目前研究过的任何植物中，分布广泛而且种类繁多。根据其在植株中所发挥的作用可以分为：固氮菌、固磷菌、固钾菌等植物促生菌^[8~9]、具有抗病虫害的生防菌^[10~13]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌^[14]。

目前对桉树根际微生物的研究主要集中在菌根方面。桉树是一种菌根营养型的树种，它不仅具有内生菌根（endomycorrhiza），也有外生菌根（ectomycorrhiza，ECM），还有混合菌根^[15~17]。国外对桉树的研究初步证实，混合菌根对桉树具有较好的促生作用，并且能提高宿主的抗逆性^[18~19]。但在促进桉树低温条件下抗寒方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一株提高按树抗冻能力的内生真菌及其应用，促进桉树低温条件下的抗寒能力。

本发明所述内生真菌为青霉（Penicillium sp.）菌株1，所述菌株1的保藏号为CGMCC No.4139。

所述内生真菌的分离筛选过程如下：

（1）野外采集桉树根、茎和叶。

（2）桉树样本消毒处理的最佳方案为：①叶片：70％酒精40s，0.1％升汞90s；②茎段：70％酒精30s，0.1％升汞60s；③根部：70％酒精50s，0.1％升汞120s。

（3）将消毒后的材料接种于改良马丁固体平板培养基。所述改良马丁固体平板培养基的配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2。

接种方法：将消毒过的外植体用接种刀切开，将其铺放在培养基表面。3～5天后观察菌株生长状况。若菌株繁殖迅速，将所产生的菌种根据外观进行分离纯化。若菌株繁殖比较缓慢且数量比较少，可适当延长培养时间，7～10d后进行分离纯化。

（4）将外观不同的菌株分别点接入平板培养基进行纯化，3～5天后观察菌株生长状况，若菌株外观（菌落颜色、表面特征、质地）还显现杂合状态，再继续将不同外观的菌种分别点接入平板进行纯化培养，经过2～3次转接，若菌种外观性状表现稳定，则菌种纯化结束，分离筛选得到能提高按树抗冻能力的内生真菌即菌株1；所述平板培养基为改良马丁固体平板培养基。

所述的内生真菌的用途，将所述内生真菌接种于桉树，具体步骤如下：

⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃。所述液体培养基配制为：改良马丁培养基,其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度。

⑶将菌液用超纯水稀释成5.0×10⁶cfu/ml。

⑷取1L稀释后的菌液浇施入植株根际。