[发明专利]艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞易感和支持HIV-1的极端表达基因群

说明书

技术领域：

本发明涉及人类基因组的疾病相关基因的表达谱研究和特征基因群的筛选。具体的讲是在人功能基因组范围内筛选艾滋病相关基因，利用细胞模型和基因芯片技术相结合的方法建立的艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞易感和支持HIV-1的极端表达基因群，属生物医学领域。

背景技术：

艾滋病(AIDS)是一种由HIV(human immunodeficiency virus，人类免疫缺陷病毒)引起的严重威胁人类健康的重大传染病。HIV-1天然的靶细胞CD4+T细胞的活化和增殖是HIV-1得以大量繁殖和广泛播散的先决条件。1996年Levine等人意外发现，经同时包被在磁珠上的CD3、CD28抗体(“CD3/CD28 beads”)刺激后，活化、增殖的CD4+T细胞，反而获得了既能抵抗感染又能清除病毒的能力——来自HIV-1感染者的CD4+T细胞活化后，能逐渐清除已感染的病毒，来自健康成人的CD4+T细胞活化后，能抵抗HIV-1而不被感染。我们以此特殊效应为基础，同时以高度易感并促进病毒增殖的PHA/IL-2活化细胞为反证，构建细胞模型并筛选出艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞易感和支持HIV-1的极端表达基因群。

发明内容：

本发明的目的在于提供艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞易感和支持HIV-1的极端表达基因群。

本发明通过采用高通量的人表达谱基因芯片，通过比较未刺激、CD3/CD28磁珠刺激(具备抵抗和清除HIV-1能力)及PHA/IL-2刺激(具备易感和支持HIV-1能力)三种状态下的CD4+T细胞基因表达差异，筛选在多样本中有共同表达趋势的差异基因，得到一组艾滋病病毒靶细胞CD4+T细胞易感和支持HIV-1的极端表达基因群，共包含8个基因，其部分或全部组合作为排除抗艾滋细胞药物的标志；该基因群在CD4+T细胞易感和支持HIV-1状态时高表达且在CD4+T细胞抵抗和清除HIV-1时低表达，基因群中的各基因的名称、序列号及主要描述见表1。

表1  易感和支持HIV-1的极端表达基因群(共8个基因)

本发明中的极端表达基因群中的基因均参与了造成不同生物学效应的显著功能(Gene Ontology，GO)和信号转导通路(pathway)，同时在信号转导网络(Signal-Net)和基因的调控网络(GeneRelNet)中处于关键结点或重要地位，因此具有代表意义。

附图说明：

图1显示易感和支持状态(P)中高表达且抵抗和清除状态(B)中低表达的极端表达基因。

具体实施方式：

1.样本的选择和处理

3例样本取自云南昆明血液中心，均为健康人外周血浓缩白细胞。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，采用CD4+T Cell Isolation Kit II human试剂盒(Miltenyi公司)对PBMC进行磁珠阴性分选，获得静息状态的CD4+T细胞。使用6孔培养板每孔3ml微量培养体系在37℃、5％CO₂培养箱中对CD4+T细胞进行体外刺激培养，培养基为RPMI 1640完全培养液[RPMI 1640+10％FBS+0.1mol/L HEPES(上海生工生物公司)]。CD3/CD28磁珠刺激(B组)：按细胞磁珠1∶3的比例接种1×10⁶CD4+T细胞/孔(Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，Invitrogen公司)，每2天换半液并传代，维持细胞密度为1～2×10⁶细胞/ml。PHA/IL-2刺激(P组)：接种2×10⁶CD4+T细胞/孔，加入5mg/ml植物血凝素(PHA)和100U/ml白介素-2(IL-2)进行刺激培养，每3天换半液补充PHA和IL-2。上述细胞刺激6天，连同未刺激(R组)的CD4+T细胞提取总RNA后作为基因芯片杂交的样本。

2.基因芯片杂交

2.1总RNA提取及纯化

采用TRIzol法提取细胞的总RNA，QIAGENKit纯化总RNA，用NanodropND-1000分析RNA浓度，1％琼脂糖电泳或Agilent BioAnalyzer 2100进行质检。

2.2cDNA第一链和第二链一步法合成

1)取2μg RNA于1.5ml离心管中，如下配置反应溶液：

总RNA 2μg(最多6.5μl)

T7 Promotor primer 5μl

RNase-free Water Xμl

总体积   11.5μl