[发明专利]特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组病毒，特别涉及一种特异促成软骨分化的核心结合因子a1(Cbfa1)基因重组病毒，还涉及该重组病毒的制备方法和应用。 

背景技术

随着软骨形成过程的组织学、细胞学和材料学研究的不断深入，对细胞因子和信号分子、细胞-材料界面相互作用的了解不断拓展，已有学者利用组织工程技术于体外形成了组织工程软骨，并显示了组织工程软骨的广阔应用前景。尽管组织工程软骨研究开展较早，技术相对较成熟，但有效合理的种子细胞来源成为限制其临床应用的瓶颈。在自体或异体软骨细胞、骨膜和软骨膜细胞、骨髓或其它组织来源的间充质干细胞(MSCs)、以及胚胎干细胞等众多备选种子细胞中，间充质干细胞因其具有来源充足、取材方便、低免疫原性、增殖能力强、可大量培养扩增等优势，成为目前组织工程软骨领域种子细胞的首选。但间充质干细胞具有多向分化潜能，为了满足组织工程软骨的构建要求，必须寻求一种能够高效、特异地促进间充质干细胞定向成软骨分化的方法。 

既往研究显示，利用多种旁分泌、自分泌来源的生物活性因子如骨形成蛋白-7、转化生长因子-β1、白介素-1等以及非蛋白性化合物如地塞米松、前列腺素E2等均可明显刺激间充质干细胞的II型胶原与蛋白多糖合成，但这些活性因子和非蛋白性化合物的特异性差，往往使间充质干细胞呈多向分化。应用软骨细胞外基质进行间充质干细胞的体外3D培养，提供适宜于干细胞成软骨分化的外部环境，可促进间充质干细胞成软骨分化，但该方法更多的是从支架材料的研发考虑，而忽略了细胞自身的生物学特性。间充质干细胞与滑膜囊巨噬细胞或胚胎颅盖细胞共培养可促进其成软骨分化，但该方法除了有导致病原传递的 危险之外，最主要的问题在于成软骨分化细胞难以与共培养细胞有效分离。因此，如何高效、特异地促进间充质干细胞定向成软骨分化，成为组织工程软骨领域目前需要解决的重要问题。 

新近研究显示，在胚胎发育期，软骨细胞和成骨细胞都来源于未分化的间质细胞。在骨骼形成过程中，部分间质细胞集缩并分化成软骨细胞构成软骨组织，形成骨骼的原始雏形，在部分软骨细胞凋亡后，随着血管侵入，成骨细胞在残存软骨基质上合成骨基质，软骨被骨替换，此过程称为软骨内成骨；同时，部分间质细胞集缩可直接分化成成骨细胞并形成骨，此过程称为膜内成骨。因此，要促进间充质干细胞定向成软骨分化，首先需要使间充质干细胞向双潜能的间质细胞分化，继而在此基础上加强间质细胞成软骨分化能力。 

Cbfa1基因是Runt结构域基因家族的重要成员之一，编码一个成骨细胞特异性转录因子，调控成骨细胞发育、分化和骨的形成。在鼠中剔除Cbfa1基因可导致成骨细胞分化完全受抑制，使骨骼的软骨内骨化成骨和膜内骨化成骨均不能发生。Chfa1-/-的头盖骨体外培养细胞已经完全丧失了向成骨细胞分化的能力，反而具有了向脂肪细胞或软骨细胞分化的潜能。尽管Cbfa1-/-鼠的软骨细胞分化和软骨形成正常，但是软骨细胞成熟即肥大化受到严重抑制。而在体外培养的软骨细胞中，过量表达Cbfa1促进软骨细胞肥大化。这些结果说明Cbfa1不仅控制成骨细胞分化和骨形成，而且还与软骨细胞肥大化有关。两项独立的转基因鼠实验进一步证实了这种观点：在II型胶原启动子和增强子的指导下，Cbfa1在软骨细胞内过表达明显地促进软骨细胞肥大化，并能够在一定程度上使Cbfa1-/-软骨细胞肥大化和凋亡，使血管侵入软骨。而在软骨细胞内过量表达Cbfa1显性负突变体，由于抑制内源Cbfa1的功能，会使软骨细胞成熟受到抑制，使软骨表现永久软骨特性。 

Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因，参与诸如性别决定、软骨形成等多种早期胚胎发育过程，在除肥大软骨细胞外的所有前体软骨细胞和软骨细胞中均有表达。Gordon等报道Sox9基因上游序列突变可影响软骨形成而导 致短指等骨骼发育异常。在软骨形成过程中，软骨细胞增殖、分化的调控过程复杂，参与的细胞因子较多，目前比较明确的是Sox9结合于软骨细胞特异增强子Co12α1，直接调控其表达；L-Sox5、Sox6与Sox9共同形成蛋白复合物协同作用于Co12α1增强子序列，增强其转录，并通过结合于PTHrP基因的启动子区上调PTHrP基因启动子活性，刺激软骨细胞早期阶段增殖和发育；Sox9与wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信号转导通路相互作用，调控软骨细胞分化。此外，最新研究显示，Sox9基因在软骨形成过程中还与其他生物因子和物理因子如低氧、电磁场等相互影响、相互作用。 

发明内容