[发明专利]冷冻法提取棘皮动物变态前幼体DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取DNA的方法，特别是一种冷冻法提取棘皮动物变态前幼体DNA的方法。

背景技术

海胆属棘皮动物门海胆纲，是一类较常见的海洋无脊椎动物，也是生物科学史上最早被使用的模式生物，它的卵子和胚胎对早期发育生物学的发展具有举足轻重的作用。海胆受精卵经早期胚胎发育、浮游幼体、匍匐变态三个主要发育阶段发育至稚海胆。海参属棘皮动物门海参纲，是一种经济价值很高的水产动物，海参发育也经由浮游幼体发育到稚海参。海参、海胆幼体形态小，一般不超过1mm，另外，在变态过程中，其形态结构、栖息方式、摄食习性等发面发生很大变化，因此死亡率也明显增加，因此提取幼体基因组DNA进行相关分析研究具有了一定意义。

水产动物的DNA提取主要见于成体，幼体DNA的提取较少，目前所见的海洋水产动物幼体DNA的提取方法为DMSO固定法，其方法为将幼体样品保存在终浓度为20％的DMSO固定液中，实验时再从固定液中取出幼体，用纯水把固定液冲洗干净，这一步骤较为麻烦，而且DMSO为强毒性物质，对实验者伤害很大。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作过程简单、无毒副作用、对操作者无伤害的冷冻法提取棘皮动物变态前幼体DNA的方法，克服现有技术的不足。

本发明的冷冻法提取棘皮动物变态前幼体DNA的方法，步骤如下：

a、在解剖镜下用微量移液器取棘皮动物幼体放入离心管中，并在-80℃条件下冷冻保存；

b、将装有棘皮动物幼体的离心管取出解冻，并在解冻后10分钟内向离心管中加入15ul裂解液，1ul的0.3mg/ml的蛋白酶K，然后放入55℃水浴锅中裂解3小时，期间每隔半小时振荡摇匀一次；所述裂解液的组分及终浓度为10mmol/LTris-Cl，50mmol/L KCL，0.5％Tween-20，PH8.0；

c、裂解完后把水浴锅温度升至85℃，水浴15分钟，以灭活蛋白酶K；裂解完的样品直接用于PCR扩增，获取扩增产物，微卫星扩增PCR体系组成如下：

反应体系      需加体积

DNA模板       1ul

10×buffer    2.5ul

引物          1.0ul/each

d NTP         2.2ul

MgCl2         1.5ul

Taq           0.35ul

dd H2O        15.45ul

Total         25ul。

本发明的冷冻法提取棘皮动物变态前幼体DNA的方法与现有技术相比，操作简单，容易控制，无毒副作用，对操作者没有任何伤害。

具体实施方式

以海胆为例，步骤如下：

a、在解剖镜下用微量移液器取1个海胆幼体放入0.2ml的离心管中，并在-80℃条件下冷冻保存；

b、将冷冻的装有海胆幼体的离心管取出解冻，并在解冻后10分钟内向离心管中加入15ul裂解液，1ul的0.3mg/ml的蛋白酶K，然后放入55℃水浴锅中裂解3小时，期间每隔半小时振荡摇匀一次；所述裂解液的组分及终浓度为10mmol/L Tris-Cl，50mmol/L KCL，0.5％Tween-20，PH8.0；

c、裂解完后把水浴锅温度升至85℃，水浴15分钟，以灭活蛋白酶K；裂解完的样品直接用于PCR扩增，获取扩增产物，微卫星扩增PCR体系组成如下：

反应体系      需加体积

DNA模板       1ul

10×buffer    2.5ul

引物          1.0ul/each

d NTP         2.2ul

MgCl2         1.5ul

Taq           0.35ul

dd H2O        15.45ul

Tota          25ul。

对于海参采用上述同样的方法操作。

将扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳法进行检测，取5ul扩增产物混合3ul上样缓冲液在琼脂糖凝胶上点样进行检测，检测结果显示通过此方法获得的DNA质量好，能用于进行各种分子生物学实验分析。