[发明专利]含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于RNA干扰技术领域，涉及siRNA及其应用，具体涉及含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA及其应用。

背景技术

由于早期的转移、高度耐受化疗和放疗等原因，使胰腺癌的预后极差。在胰腺癌的进程中，生长转化因子β(TGF-β)的异常表达起到了关键性的作用。高表达的TGF-β能促进肿瘤的生长、侵润、转移及血管生成，另外，肿瘤来源的TGF-β具有很强的抑制机体免疫的作用，能帮助肿瘤建立免疫逃逸机制。如何抑制肿瘤介导的免疫抑制，是今后治疗胰腺癌的一大挑战。针对这个与肿瘤生长、浸润、转移及免疫逃逸相关的重要分子，目前最有效的方法之一是使用小干扰核糖核酸技术(siRNA)直接沉默，以阻断其促进肿瘤生长的通路。这种含21-23个碱基对的特异双链RNA序列，其反义链能靶向识别这些分子相应的信使RNA(mRNA)，并在相关酶的协同作用下，剪切mRNA从而干预TGF-β的蛋白合成。但前期临床肿瘤治疗效果并不理想，原因可能与其作用靶点单一、不能有效激活机体对肿瘤的免疫监视/杀伤功能、缺乏直接促进肿瘤细胞凋亡作用等有关。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA，该ppp-siRNA分子同时具备TGF-β特异性基因沉默、激活机体免疫应答和直接促进肿瘤细胞凋亡的三重功能，从而能很好的抑制肿瘤。

本发明的另一目的是提供该siRNA的应用。

本发明的技术方案如下：

含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA(简称为ppp-TGF-β)，其反义链和正义链序列5’端均为一鸟嘌呤核苷，该鸟嘌呤核苷戊糖3’位点上修饰有一个自由三磷酸基团。

所述的TGF-β特异性siRNA序列选自：ppp-TGF-β1，其正义链序列为SEQ IDNO.1，反义链序列为SEQ ID NO.2；ppp-TGF-β2，其正义链序列为SEQ ID NO.3，反义链序列为SEQ ID NO.4。

本发明所述的含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明所述的含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。

本发明的有益效果：

发明人通过大量实验设计并筛选出具有良好基因沉默功能的小鼠和人TGF-β特异性siRNA，通过设计5’→3’端依次含有TGF-β特异性siRNA的eDNA序列、胞嘧啶核苷及T7RNA聚合酶启动子序列的DNA模板，在体外利用T7RNA聚合酶转录合成得到5’端含自由三磷酸基团的TGF-β特异性siRNA(以下简称ppp-TGF-β)。该ppp-TGF-β通过如下三种机制抑制肿瘤：

(1)本发明ppp-TGF-β能有效地特异性沉默TGF-β基因，抑制TGF-β蛋白的表达。

(2)本发明ppp-TGF-β能被细胞胞浆内的特异性识别受体-视磺酸诱导基因-I(RIG-I，一种真核细胞胞浆螺旋酶，参与机体抗病毒的固有免疫)识别，并激活其下游I-型干扰素信号转导通路，能诱导细胞产生IFN-β和干扰素诱导蛋白10(IP-10)、显著提高肿瘤细胞免疫递呈分子MHC-I的表达(能提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别、攻击)，从而激活细胞及机体对肿瘤的免疫应答。

(3)本发明ppp-TGF-β还能激活内源性凋亡通路中caspase-9而促进肿瘤细胞凋亡。

本发明将TGF-β特异性基因沉默作用机制和诱导真核细胞抗病毒的固有免疫作用机制，引入到抗肿瘤的治疗中，不仅能抑制介导肿瘤免疫逃逸的重要分子TGF-β，还能有效激活机体的抗肿瘤免疫，能显著性地提高治疗肿瘤的效果。有效地解决了传统siRNA(OH-RNA)仅有单一基因沉默功能，而治疗肿瘤疗效不佳的问题。故本发明ppp-TGF-β可在制备治疗肿瘤特别是胰腺癌的药物中应用。

附图说明

图1实施例2中定量RT-PCR检测ppp-TGF-β特异性基因沉默及免疫诱导功能结果图。