[发明专利]PopW抗菌蛋白与荧光假单胞菌的混合生防制剂PopW-PF1

权利要求书

1.一种生防菌，其特征在于，该生防菌4AT8为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，保藏日期：2010年05月13日，保藏号为CGMCC NO.3834。

2.用权利要求1所述生防菌制备的生防菌剂。

3.权利要求2所述生防菌剂的制备方法，包括：

1)将权利要求1所述荧光假单胞菌4AT8接种到KB培养液中分别培养28℃180rpm，16～20小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；所用的KB即金氏B的配方为：蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄.7H₂O1.5g/L，加入水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌；

2)当培养至OD值在0.5～0.8之间时，将种子菌液以1∶100体积比加入KB培养液中，28℃180rpm振荡培养20～24小时，成品中活菌总浓度为1×10⁹CFU/ml。

4.权利要求2或3所述生防菌剂在防治蔬菜和大田作物病害中的应用。

5.一种PopW抗菌蛋白与权利要求1所述生防菌的混合生防制剂PopW-PF1，该制剂含有来自青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)ZJ3721的popW基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达产物抗菌蛋白PopW和权利要求2或3所述生防菌剂。

6.根据权利要求5所述混合生防制剂PopW-PF1，其中PopW抗菌蛋白制备的方法为：将含有青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)ZJ3721的popW基因的重组质粒pET-popW转化大肠杆菌BL21(DE3)中，阳性克隆接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养过液，第二天按1％的比例接入含有50mg/L卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养3小时，然后加入终浓度为1.0mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，37℃继续振荡培养3h，将摇好的菌液6,000g，4℃，离心10min，收集菌体，然后用1/100体积的20mM tris-HCL，PH 8.0缓冲液，加入终浓度为1mM苯甲基磺酰氟PMSF重悬菌体，超声波破碎菌液至清透，10,000g，4℃，离心20min收集上清液，收集到的上清即为可溶性蛋白PopW，PopW的浓度为30mg/ml，大小为40KDa。所用的LB的配方为：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，加入水溶解，最后定容至1000mL，调pH 7.0-7.2，分装后高压灭菌。

7.根据权利要求5或6所述的混合生防制剂PopW-PF1是由浓度为30mg/ml的PopW抗菌蛋白与活菌总浓度为1×10⁹CFU/ml的荧光假单胞菌4AT8生防菌剂按体积比为30000-30∶1混合而成，使用时稀释50-100倍。

8.权利要求5-7之一所述的混合生防制剂PopW-PF1在防治蔬菜和大田作物病害中的应用。