[发明专利]胡杨PeNHX1/3/6基因功能分析与利用

说明书

技术领域

本发明涉及来自胡杨(Populus euphratica Olive)的PeNHX1/3/6基因功能的分析及其利用。

技术背景

胡杨(Populus euphratica Olive)是唯一能在干旱盐碱和温差剧烈变化的干旱沙漠地区生长的乔木建群树种。作为天然的抗逆性极强的典型植物，胡杨已引起国际学术界的重视。研究、开发和利用胡杨抗逆性基因资源，对于深入林木抗逆性机理以及定向培育抗逆林木新品种具有重要的价值。而Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(Na⁺/H⁺ exchanger，NHX)在耐盐中起到重要作用，它的功能不仅仅是解除Na⁺的毒性，在细胞器的发生及离子均衡过程中还执行体积和渗透调节的功能，是保持细胞离子均衡的关键因子。研究表明，NHXs在植物逆境胁迫及信号传导过程中起到重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供胡杨中的一种与逆境相关的NHX基因，该基因在抗盐反应中具有重要作用。本发明所提供的NHX基因来源于胡杨，是NHX基因家族中的，为PeNHX1/3/6。

序列表中序列氨基酸残基序列分别是由528/545/533个氨基酸残基组成的蛋白质。

逆境相关基因PeNHX1/3/6是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列。

2)与序列中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

本发明所提供的逆境相关基因PeNHX1/3/6，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，可获得对高盐胁迫抗性增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以使用增强子，但是必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择性标记，通常使用的可选择性标记可以是编码对抗生素(包括庆大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。

携带有本发明的逆境相关基因PeNHX1/3/6基因的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，以培育抗盐的植物品种，例如Ti质粒、Ri质粒、电穿孔、微注射、植物病毒载体、直接DNA转化或植物病毒载体等，所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明：

附图说明

无

具体实施方式

实施例1，胡杨总RNA的提取

用CTAB(萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，第三版)的方法从高盐处理的胡杨中提取总RNA。

实施例2，胡杨PeNHX1/3/6 cDNA序列的克隆

总RNA用逆转录酶反转录合成cDNA，然后分别用引物PeNHX1：5′-ATGAATTTCGGTTTGAGGATG-3′和5′-TTCGGTTTGAGGATGGTAT-3′；PeNHX3：5′-ATGGAAGCTTATATGAGTTCAATTG-3′和5′-ACTATGCTGGGCGTGCTAA-3′；PeNHX6：5′-ATGTCGACTGTAGTAGAGGAA-3′和5′-TAGTTGTGTTGACGGTGCTT-3′对该cDNA进行PCR。PCR程序为：(1)94℃，变性5分钟。(2)PCR扩增，35个循环：94℃，变性45秒；56℃退火45秒；72℃，延伸78秒。(3)72℃，延伸10分钟。将PCR产物用琼脂糖进行电泳分离，然后用天根的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片断并与TaKaRa公司的pMD18载体进行连接，连接的反应体系为：目的片断4μl，1μl pMD18vector，5μl Solution Ⅰ，于16℃过夜连接，再将连接产物转化进感受态的大肠杆菌Top10，用PCR的方法检测阳性菌株，最后取转化成功的菌株在上海生工进行DNA序列测定。