[发明专利]一种乙型脑炎疫苗的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙型脑炎疫苗的纯化方法，具体涉及一种利用分子筛层析和离子交换膜层析纯化灭活病毒乙型脑炎疫苗的方法。

背景技术

用现代生物技术改造传统疫苗产品，提高传统疫苗的安全性、保护效果并使疫苗生产过程的控制和产品质量的控制完全达到现代制药管理要求是国家重点支持的高新技术的发展方向(《高新技术产业化“十一五”规划》国家发展与改革委员会)。采用以大规模动物细胞培养技术、大规模层析纯化技术和新型制剂技术为核心的疫苗生产工艺是实现该目标的主要途径。然而，这些新技术还有待于进一步发展。以纯化技术为例，由于新疫苗生产工艺的基础是传代细胞，如何去除产品中的残留DNA是疫苗安全性的重要因素，也是国家疫苗质量标准的关键指标。

现有的灭活病毒乙型脑炎疫苗的纯化工艺流程一般是将病毒培养液通过过滤或者离心沉淀澄清后，经超滤浓缩至一定体积，再加入一定浓度的甲醛或者β-丙内酯灭活得到灭活病毒浓缩液，然后进一步提纯抗原活性组分；或者是将病毒培养液通过过滤或者离心沉淀澄清后，首先加入一定浓度的甲醛或者β-丙内酯灭活病毒，经超滤浓缩至一定体积，然后进一步提纯抗原活性组分。其中，获得灭活的病毒浓缩液的工艺比较通用，而对灭活的病毒浓缩液进一步提纯的方法却有多种方法：

方法一：向灭活的病毒浓缩液加入硫酸鱼精蛋白后离心沉淀去除DNA，然后采用蔗糖密度梯度区带离心方法进行提纯；

方法二：灭活的病毒浓缩液经硫酸鱼精蛋白沉淀后离心去除DNA，采用一种或多种分子筛层析柱一次或多次层析进行提纯；

方法三：将灭活的病毒浓缩液经蔗糖密度梯度区带离心后，经一步或多步离子交换柱去除DNA；

方法四：灭活的病毒浓缩液经分子筛层析后，再采用离子交换柱进一步提纯抗原。

由此可见，传统的生产提纯的乙脑疫苗多采用超速离心技术进行纯化，但由于超速离心设备昂贵，不易保养维修，一旦出现故障，问题往往比较严重，操作繁琐，且不易保持无菌，在设备与人力的投入上都大大超过了使用层析技术所需的投入，不适于大规模的工业化生产。采用超速离心法提纯抗原在纯化效果上也无法有效地去除与病毒性质相近的DNA，而DNA含量又是影响产品安全性的一个重要因素。单步分子筛法是指得到灭活病毒浓缩液后，通过一种或多种分子筛填料进行层析提纯。这种方法仅仅通过分子量大小不同的单一原理来分离杂质，只能分开不同分子量的物质，而对于相近分子量的物质就算经过更长的层析路径也无法分离，对于与抗原分子量相近的杂质，特别是DNA无法做到有效的去除。而且为了追求一步实现更高的蛋白去除率需要将抗原通过更长的层析路径，病毒表面的蛋白难免受到破坏，降低了抗原的免疫原性，而为了保障足够的效力，每次则需要加入更高含量的抗原，结果造成接种时出现更高概率的不良反应。

传统的离子交换层析采用离子交换填料作为柱层析介质，而离子交换填料是在琼脂糖或葡聚糖等颗粒的骨架上连接阳离子或者阴离子等基团，90％的基团是位于填料颗粒内部，在分离纯化例如病毒等大分子物质时，大分子物质无法进入颗粒胶的小孔内，无法与孔内的基团结合，造成了传统填料载量无法满足层析工艺的要求或者造成了90％以上的浪费。

因此，进一步探索灭活病毒乙型脑炎疫苗的纯化方法具有重要的实际意义。

发明内容

因此，本发明的目的在提供一种改进的乙型脑炎疫苗的纯化方法，该纯化方法将分子筛层析和离子交换膜层析技术相结合对灭活的病毒浓缩液进行纯化，能够在保护疫苗的免疫原性的基础上有效地去除杂质，尤其是对产品安全性有重要影响的DNA，同时缩短了乙型脑炎疫苗的纯化时间，降低了生产成本。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一种乙型脑炎疫苗的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：

(1)将灭活的乙型脑炎病毒浓缩液经聚丙烯葡聚糖分子筛柱层析，洗脱溶剂为pH为7.5～8.5的磷酸缓冲液，紫外检测器波长280nm处检测；

(2)收集第一洗脱峰，以带有季铵阳离子的醋酸纤维素膜进行离子交换层析膜层析，采用线性洗脱且洗脱溶剂由体积比为缓冲液A∶缓冲液B＝0～100％匀速变化至缓冲液A∶缓冲液B＝100％～0，其中缓冲液A为pH7.5～8.5的磷酸缓冲液，缓冲液B为包含500mM/L氯化钠的pH 7.5～8.0的磷酸缓冲液，洗脱速度为200～600厘米/小时；

(3)收集NaCl浓度为70～250mM之间的洗脱液。