[发明专利]一种体外培养人体黏膜活组织模型及其建立方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物医学技术领域，涉及传染性疾病的体外感染模型，具体涉及性传播疾病预防、以及粘膜免疫中感染模型及其建立方法，尤其涉及一种体外培养人体黏膜活组织模型及其建立方法和应用

背景技术

据报道，我国男性接触人群(Men who have sex with men，MSM)艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)感染的比例迅速地增长。2009年新发感染者中，MSM感染者的比例已高达30％。诸多研究显示，MSM间无保护的肛肠性行为发生感染HIV的风险是生殖道性行为的十几倍甚至数十倍之多。此外，异性之间也有采用直肠性接触的报告，该种行为方式，明显促进了HIV的粘膜感染与传播。因此，阻断HIV粘膜的传播和局部生殖道播撒是预防感染和最终遏制HIV流行的关键。目前，完成这个目标的最佳策略是通过设计和实施有效的疫苗与局部微生物杀菌剂，抑或暴露后预防用药的时机与时效的研究，而这些均要求深刻理解HIV粘膜感染的机制，准确评价生物预防技术的安全性。

目前，国内外粘膜感染研究所采用的动物模型绝大多数是HIV和猴免疫缺陷病毒SIV的嵌和病毒SHIV/非人类灵长类(猴子)模型，实验需要在大动物生物安全三级实验室(P3)进行，成本较高，而且动物的来源与实验设施的可及性均受到很大限制。近年来，有学者开始探索建立新型粘膜活组织模型如女性生殖道组织以及肠道粘膜活组织模型等，但是培养组织结构完整性与高活性一般维持3-7天，时间较短，无法满足模拟HIV感染生物轨迹需求(一般细胞培养7-10天以上，才会观察到明显的病毒复制增加)。此外，国外在研究中采用的病毒株绝大多数具有多重复制周期(包括HIV-1病毒临床分离株或实验室构建的感染性克隆)，相关实验需要在普通的P3实验室中完成，实验仍然受到一定限制。假病毒感染体系由编码病毒包膜蛋白的质粒与病毒骨架质粒共同转染哺乳动物细胞系而制备的单一感染周期的病毒，感染靶细胞之后不具有复制能力，不形成子代感染性病毒颗粒，因此，相关实验可以在生物安全二级实验室(P2)中进行。迄今为止，国内尚无有关采用假病毒感染体系进行此类研究的报告。

发明内容

本发明的目的在于针对HIV-1感染宿主研究的适宜动物模型的局限性，提供一种体外培养人体黏膜活组织模型，尤其是建立一种HIV粘膜感染活组织模型及其建立方法和应用

本发明建立的HIV粘膜感染活组织模型可再现HIV-1感染人体靶细胞的真实轨迹，为HIV-1粘膜感染机制研究、以及阻断粘膜感染的新型生物预防技术和粘膜局部应用的抗病毒药物的安全性和有效性的临床前评价研究提供技术平台。

本发明的一种体外培养人体黏膜活组织模型，其特征在于，通过病毒感染离体后体外培养的粘膜组织，模拟病毒粘膜感染的生物学轨迹，建立了体外培养人体黏膜活组织模型。该模型可作为研究艾滋病病毒(HIV)粘膜免疫的体外模型。

本发明中，所述的离体粘膜组织包括但不限于HIV性传播途径的生殖道/器或消化道组织如肠道粘膜等；

本发明中，所述的病毒包括但不限于HIV的单一感染周期的假病毒、感染性克隆、实验室株、临床分离株或其他种类病毒。

具体而言，本发明的体外培养人体黏膜活组织模型，通过下述方法和步骤制备：

1、对离体组织样本预处理

对离体的临床手术标本组织进行预处理，本发明中(以肠粘膜为例)，肠道手术男性患者控制年龄范围在40-60岁之间(与MSM的HIV性传播高危人群年龄段之一近似)，如为肿瘤患者则选取行mills术且病理诊断所取标本无癌细胞转移及其他异常病变的癌旁组织；非肿瘤患者(如直肠脱垂、肠梗阻等)则取离体标本病灶远端的正常组织；标本离体后尽快取下组织块，浸入器官移植保护液，1-2小时内运至实验室。用含高剂量抗生素(青链霉素：2000U/ml)的DMEM培养基冲击并清除组织块中附着的细菌、真菌等污染物，保证培养期间无污染现象发生。以上取材要求及培养环节均是延长组织高活性培养时间并保持组织结构完整的重要条件。

2、组织培养：

采用下述培养方式：