[发明专利]重组鼠李糖乳杆菌工程菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学领域，具体涉及提高抗氧化能力的重组鼠李糖乳杆菌工程菌株及其制备方法。

背景技术

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌的泛称，是国际公认的一大类益生菌，乳酸菌发酵产品已经成为最主要的功能性食品。乳酸菌大多数属于兼性厌氧细菌，生长过程一般不需要氧气，而且氧气的存在可能对其造成危害。氧化胁迫主要来自于各种活性氧品种(Reactive oxygen spicies，ROS)，包括超氧阴离子(O₂^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(·OH)等，ROS能够破坏蛋白质、核酸、细胞膜等生物大分子，导致细胞衰亡，其中·OH危害性最大。

在进化过程中，细菌细胞内出现了各种抗氧化酶类，其中最重要的是超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)，前者能够降解O₂^-，后者能够清除H₂O₂，最终阻止·OH的积累，保护细胞不受氧化压力的危害。然而，大多数乳杆菌属缺乏超氧化物歧化酶基因，只有少数菌种含有过氧化氢酶基因，因而耐氧化压力弱。

研究表明，鼠李糖乳杆菌是一种典型的具有益生功能的乳杆菌，其染色体上不含有CAT和SOD基因，抗氧化胁迫能力较弱，作为一种常用的功能性乳酸菌，在发酵产品加工过程中会受到各种氧化条件的危害，造成产品品质下降。

近年来，通过导入外源基因的方法提高受体菌株抗氧化能力的技术飞速发展。人们将来自于植物乳杆菌、清酒乳杆菌、枯草杆菌和嗜热链球菌中的CAT基因和SOD基因转入各种耐氧能力弱的乳酸菌受体中，成功提高了这些乳酸菌的抗氧化水平，在鼠李糖乳杆菌中却并未报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组载体，携带有细菌过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因，能够表达出过氧化氢酶和超氧化物歧化酶。

所述过氧化氢酶基因克隆自清酒乳杆菌，所述超氧化物歧化酶基因克隆自嗜热链球菌。

所述超氧化物歧化酶基因还包括其自身启动子。

所述PCR扩增过氧化氢酶基因的引物为5’-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3’和5’-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3’；所述PCR扩增超氧化物歧化酶基因的引物为5’-CCGCTCGAGCAAGATTTTGTAAG-3’和5’-GGGGTACCTGAGGATGATTCTAGAC-3’。

本发明的另一个目的是提供一种重组鼠李糖乳杆菌工程菌株，该菌株含有能表达过氧化氢化酶和超氧化物歧化酶的重组载体。

本发明的另一个目的是提供一种重组鼠李糖乳杆菌工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和嗜热链球菌的基因组中扩增过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因片段；

2)将扩增得到的过氧化氢酶基因和超氧化物歧化酶基因串联构建到大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒载体pSIP502(Sorvig et al.，2003)上，获得重组质粒；

3)将重组质粒转化大肠杆菌，培养大肠杆菌并提取质粒；

4)通过电穿孔法将重组质粒转化到鼠李糖乳杆菌AS 1.2466。其中鼠李糖乳杆菌AS 1.2466为中国普通微生物菌种保藏管理中心中国科学院微生物研究所保藏的标准菌株，保藏号为CGMCC 1.2466T。

本发明的另一个目的是提供所述的重组鼠李糖乳杆菌在发酵食品工业上的应用。

本发明提供的含有katA和sodA共整合重组质粒的鼠李糖乳杆菌能显著提高该鼠李糖乳杆菌的耐H₂O₂毒性的能力。经过测定，转入katA重组质粒和转入katA和sodA共整合重组质粒的鼠李糖乳杆菌在6mM H₂O₂处理1h后的存活率分别为81.5％和100％，比含有空白对照质粒的鼠李糖乳杆菌的存活率高出近一千倍；而转入共整合质粒pSIPCS的鼠李糖乳杆菌在更高浓度的H₂O₂处理之后的存活率比只含有CAT的鼠李糖乳杆菌又高出100多倍。同时，转入katA和sodA共整合重组质粒的鼠李糖乳杆菌，能在通气的培养条件下有更多的活菌数，存活的天数也更长，大大提高了抗氧化能力。

附图说明