[发明专利]一种猪瘟活疫苗的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪瘟活疫苗的生产方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病，在世界上很多国家和地区均有发生，给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为法定通报性疫病，我国将其划为一类动物传染病。

目前世界上主要有3种效果较好的猪瘟活疫苗，即日本的GPE株、法国的Thiverval株和中国的兔化弱毒株(C株)，其中兔化弱毒株应用最为广范并为世界上许多国家猪瘟的控制和消灭做出了重要贡献。目前，我国也实行强制免疫猪瘟弱毒活疫苗作为控制猪瘟的主要手段。

虽然三种疫苗均能有效用于猪瘟防制，但也都存在着一定不足。其中GPE株、Thiverval株是用猪源传代细胞系生产的，其存在已知或未知外源病毒污染的风险较大，一旦控制不好，很容易导致某种已有的或新发现的传染病大面积流行。其中兔化弱毒活疫苗目前有两种生产工艺，第一种工艺是用兔体生产，取接种家兔的组织或淋巴结或脾脏制苗，该工艺可以有效避免外源病毒污染，同时保证了病毒的遗传稳定性，病毒毒力不返强，但需要使用大量家兔，质量控制难度较高且生产成本较高；第二种工艺是应用牛、羊原代细胞或猪传代细胞生产，该工艺避免大量使用实验动物，但存在外源病毒污染的风险(因为牛、羊原代细胞或猪传代细胞对很多已知或未知的外源病毒易感)并且病毒遗传稳定性稍差，病毒有独立返强的风险。另外，猪瘟兔化弱毒是经过兔体连续传代驯化而成的，种毒并未经过克隆纯化，因次不同批次的种毒对同一批家兔或同一批次的种毒对不同批次的家兔感染性和免疫原性往往存在一定差异。由此可见，亟需一种新的猪瘟活疫苗生产工艺来克服已有的几种疫苗存在的不足。

发明内容

本发明的目的是克服猪瘟活疫苗现有生产工艺的不足之处，提供一种用克隆化猪瘟兔化弱毒种毒接种兔源细胞或常用细胞进行细胞培养，收获病毒液生产猪瘟活疫苗的方法。该方法具有生产工艺简单、易于质量控制、外源病毒污染风险小、生产成本低等特点。利用本发明生产的猪瘟活疫苗遗传稳定性好、纯净性高、病毒效价高、免疫原性强。本发明是用猪瘟兔化弱毒株病毒经过病毒基因拯救技术获得的一株猪瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC-2，该病毒株已于2010年7月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4059，将CSFV CC-2通过兔源细胞和/或常用细胞进行细胞培养，收获病毒液；将收获的病毒液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻真空干燥而制成冻干活疫苗，每头份含毒量不低于6000TCID₅₀或400RID。包括以下技术步骤：

1猪瘟兔化弱毒的克隆与鉴定

CGMCC No.4059猪瘟兔化弱毒克隆株病毒是通过应用病毒基因拯救法将猪瘟兔化弱毒进行克隆，获得高度适应兔源细胞或常用细胞、基因型单一并且能稳定遗传的纯系猪瘟兔化弱毒株病毒。

1.1猪瘟兔化弱毒的克隆

用病毒基因拯救法进行。

(1)病毒RNA提取：RNA提取试剂盒提取猪瘟兔化弱毒细胞培养液的总RNA；

(2)全基因组cDNA克隆：

①设计几对引物分别进行RT-PCR扩增，分别进行纯化、回收，电泳检测扩增产物；

②将PCR产物分别克隆到载体上，转化感受态细胞；

③挑取转化成功的菌落，大量培养，提取重组质粒，双向测序鉴定；

④将重组质粒，酶切，纯化；

⑤将纯化产物连接，得到全基因组cDNA；

⑥将全基因组cDNA克隆到载体上，转化感受态细胞；

⑦筛选重组载体，扩大培养，提取重组质粒，酶切，纯化，得到大量全基因组cDNA；

(3)体外RNA转录；

(4)体外RNA脂质体转染细胞；

(5)培养传代，荧光抗体检测呈阳性，则克隆成功，命名为CSFV CC-2(该病毒株已于2010年7月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4059)；

1.2克隆株的鉴定

经鉴定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性：