[发明专利]文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因及其应用

权利要求书

1.通过引物扩增基因片段和RACE基因UTR序列的方法，从文昌鱼总RNA中克隆得到文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

2.由权利要求1所述的文昌鱼富含亮氨酸蛋白ALM基因编码的富含亮氨酸蛋白ALM，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。

3.重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的表达方法，其特征在于：根据权利要求2所述的富含亮氨酸蛋白ALM的结构域，通过表达载体pET-21b，分段在大肠杆菌中以胞内包涵体的形式表达。

4.根据权利要求3所述的表达方法，包括以下步骤：

1)重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3的构建；

2)将重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)；

3)对转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)进行培养；

4)重组文昌鱼非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的提取和变复性处理。

5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，在步骤1)中所述的重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3的构建包括以下步骤：

a)依据权利要求1所述的ALM基因的序列和权利要求2所述的ALM蛋白的结构，合成三对引物，LRR1上游引物LRR1-up为5’atGGATCCTATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’，LRR1下游引物LRR1-low为5’-taCTCGAGCCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’，LRR2上游引物LRR2-up为5’-atGGATCCGATGCTACAACTCAACAACAAC-3’，LRR2下游引物LRR2-low为5’-taCTCGAGCCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’，LRR3上游引物LRR3-up为5’-atGGATCCTATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’，LRR3下游引物LRR3-low为5’-taCTCGAGCCGCAGAACAGACAGGACATC-3’，其中，上游引物均含有BamH I切割位点，下游引物均含有Xho I切割位点；

b)以含有ALM基因的pGEM T easy vector质粒为模板，以LRR1-up和LRR1-low、LRR2-up和LRR2-low、LRR3-up和LRR3-low为引物，高保真聚合酶PCR扩增基因片段；

c)将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pET-21b上，得到重组表达载体pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3。

6.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，步骤3)的培养条件为：将单菌落接种于10ml含有100mg/L氨苄青霉素抗性LB液体加富培养基中，37℃剧烈震荡培养16小时，作为种子菌；取种子菌按1∶100的比例接种于含氨苄青霉素的LB液体加富培养基中，37℃剧烈震荡放大培养至OD₆₀₀约为0.5～0.6；加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃诱导表达6小时；4℃、8000rpm离心15分钟，收集菌体。