[发明专利]抗人心肌肌钙蛋白I特异性单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及以抗体为特征的体外实验用的生物制品，更具体的说，是一种抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)特异性高的单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

急性心肌梗死(AMI)的早期诊断和及时治疗是降低死亡率的关键。心肌组织特异性标志物的测定是AMI诊断、监测病程与评价预后的主要指标。传统使用的早期标志物为肌红蛋白(Mb)、乳酸脱氢酶(LDH)同工酶、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)等，临床实践证实这些心肌损伤标志物大都存在特异性不强、升高时间较晚和持续时间相对短等缺陷。近年来，心肌肌钙蛋白I(cTnI)以其高度的灵敏性和组织器官特异性及较长的诊断窗口期，在AMI和其他心脏疾病的诊断中显示出其特殊的优越性，并愈来愈多的受到临床医生和临床化学家的关注和青睐。国际临床化学联盟(IFCC)的心肌标志物标准化委员会(CSCM)的美国临床生化学院(NACB)最近建议在临床工作中将心肌肌钙蛋白I作为急性心肌梗死诊断的“金标准”。

目前，我国临床上使用的cTnI诊断试剂盒多为进口产品、或进口原料国内组装。这些进口产品价格昂贵，限制了这一特异、灵敏的生化标志物在国内的广泛推广和应用。研制出具有自主知识产权、完全国产化的cTnI诊断试剂盒是当前急需。我们围绕cTnI检测试剂盒的国产化进行了深入的研究和探索。在研究中发现有两个问题严重制约着cTnI诊断试剂盒的国产化进程：(1)首先是试剂盒的重要组成成分cTnI抗原的来源问题，传统的方法是从猝死者心肌组织中采用生化方法提取，但目前人心肌组织的来源及其困难，且质量也难以保证，致使其产率极低，抗原活性也不理想。(2)试剂盒的关键试剂抗体特异性：多克隆抗体结合位点多，特异性、均质性相对弱，制备出用于心血管疾病临床诊断的高亲和力、高特异性的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体是解决问题的关键。

随着分子生物学和基因重组技术的飞速发展，有关体外表达重组人心肌肌钙蛋白I(，rhcTnI)的文献在国内外均有报道。但大部分研究工作还处在实验室的阶段，至目前为止尚未见商品化的重组人心肌肌钙蛋白I问世。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株B10A6其保藏号为：CGMCC NO 3951。

本发明的另一个目的是提供一种由抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株CGMCC3951分泌的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供一种抗cTnI单克隆抗体的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株B10A6其保藏号为：CGMCC NO 3951。

抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株B10A6，该杂交瘤细胞株于2010年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保臧号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC NO 3951。

本发明所述的抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株，该细胞株，能分泌抗人心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。

本发明提供了由抗人心肌肌钙蛋白I杂交瘤细胞株CGMCC3951分泌的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体免疫球蛋白类别及亚类分别为IgG和IgG3且与人心肌肌钙蛋白I特异结合；其效价为1∶16000，亲和常数：1.08×10^-9mol/L。

本发明所述抗人心肌肌钙蛋白I特异性单克隆抗体的DNA基因序列为679bp，如图3所示。其所编码的氨基酸序列如图11所示。该cTnI抗体-免疫球蛋白IgG分子量约为150kD，由两条分子量约为50kD的重链和两条分子量为25kD的轻链组成(如图9)。

本发明采用RT-PCR方法从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人心肌肌钙蛋白I基因，将其插入到pMD19-T克隆载体中，经酶切和测序对目的基因分析，再插入到pET-21a(+)表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和采用锐普心梗仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量。从已构建的重组人cTnI的基因工程菌表达蛋白中分离纯化cTnI作为抗原免疫Balb/c小鼠，取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞，采用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnI的McAb阳性克隆，并利用体内诱生法大规模制备McAb，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体，鉴定抗体的性质。

附图说明：