[发明专利]一种基于18O标记的N-糖链相对定量方法

说明书

技术领域

本发明属分析化学技术领域，具体涉及一种糖链相对定量方法，尤其涉及一种基于¹⁸O标记的N-糖链相对定量方法。

背景技术

蛋白质糖基化是生物体内最普遍、最重要、也是最复杂的蛋白质翻译后修饰(PTMs)之一，参与多种生物学过程，在生命活动中发挥着重要功能。在医学上，糖蛋白与糖链是潜在的疾病分子标志物和药物靶标，为多种疾病的早期诊断和治疗提供了可能。随着糖基化修饰和糖链研究的深入，仅限于对糖基化修饰和糖链的定性研究已不能满足生物、医学研究的需要，而对不同样品间的特定糖基化修饰或糖链进行相对定量研究具有更大的意义。因此，糖组学，特别是基于糖链相对定量的定量糖组学应运而生，引起了生物、医学等领域的广泛关注。

目前，定量糖组学主要有非标定量和同位素标记定量两种方法。这两种方法都是基于质谱检测的。非标定量是将需要定量的几组糖链样品分别进行质谱检测，再由谱图峰强度或峰面积，经过特定的软件计算，得到相对定量结果。非标定量操作简单，省时，但是定量结果准确度较低。同位素标记定量是将需要定量的几组糖链样品先分别进行相应的同位素标记，然后等量混合，进行质谱检测，将所有的样品都展示在一张质谱图上，每组样品峰之间相差相应同位素的分子量差，再由峰强度或峰面积得到定量结果。同位素标记定量操作较为繁琐，但是由于所有样品展示在一张谱图上，且不同同位素的离子化效率几乎相同，因此定量结果准确度高。现在发展的标记定量主要有，基于同位素碘甲烷标记的全甲基化方法，基于同位素苯衍生物标记的糖链还原末端标记方法，和基于同位素类似物标记的代谢标记方法。这些方法都存在一些问题，不仅操作繁琐，而且涉及化学反应，需要额外的试剂与步骤，并会产生副反应，影响标记效率和质谱检测。

我们最近发展的糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法，通过酶催化的方法将同位素 ¹⁸O引入糖链，很好地弥补了上述同位素标记方法的不足。但要应用到糖链的相对定量中并取得良好的效果，依然需要一定的修正方法，这是由于标记与不标记的糖链分子量仅相差2道尔顿，会有较严重的同位素峰重叠；且由于技术限制，¹⁸O水中的¹⁸O元素的比例达不到100％，因此仍会有一定量的¹⁸O元素存在，造成由于标记不完全而形成的同位素峰重叠。

本发明提出的基于¹⁸O标记的N-糖链相对定量方法，通过公式计算，成功解决了同位素 ¹⁸O标记的糖链与不标记的糖链在质谱中同位素峰重叠的问题，在扣除同位素峰重叠之后，在两个数量级的动态范围内，取得了良好的线性和较低的变异系数，为糖苷内切酶催化同位素标记N-糖链的方法在定量糖组学中的应用提供了修正方法。

发明内容

本发明的目的在于为¹⁸O标记的N-糖链提供一种相对定量的方法，以解决同位素¹⁸O标记的糖链与不标记的糖链在质谱中同位素峰重叠的问题。

本发明提出的基于¹⁸O标记的N-糖链相对定量方法，是通过质谱检测¹⁸O标记的糖链和不标记的糖链，得到若干对相差2道尔顿的糖链对峰。具体是将糖苷内切酶催化生成的同位素¹⁸O标记的N-糖链与糖苷内切酶催化生成的不标记的N-糖链按等摩尔比混合为溶液，由生物质谱检测峰强度，再经计算消除同位素峰重叠后，进行相对定量；其中溶液体系为50％乙腈0.1％三氟乙酸的水溶液。

上述混合溶液中，同位素¹⁸O标记的糖链与不标记的糖链在生物质谱中表现为两个分子量相差2道尔顿的独立峰。

由生物质谱检测到的峰强度，按下列公式计算消除同位素峰重叠：