[发明专利]一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽。

背景技术

流行性感冒病毒称流感病毒，是一类具有高度传染性的呼吸道病毒，也是被列入生物恐怖武器的其中一种。。目前，接种流感病毒疫苗被认为是预防流感发生与控制病毒传播的最佳方法，但由于流感病毒变异速度非常快，致使WHO每年都需要公布当前流行性病毒疫苗，给疫苗的研制和生产造成诸多不便。因此研制一种具有广泛保护作用的疫苗对于控制流感病毒流行具有极其重要的意义。

而且，目前的流感亚单位疫苗主要是通过PCR的方法扩增基因，再通过质粒转化大肠该菌，获得工程菌，最终获得重组蛋白。操作过程繁琐，且耗时。本发明多肽采用化学合成的方法，简单快速，且有良好的抗原性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽。

为实现上述目的，本发明合成多肽的序列为：CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。

上述合成多肽的筛选方法为：

(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用以知DNA-STAR进行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点之间具有良好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片段；

(2)对候选肽段通过抗体的筛选，最终得到针对新型H1N1、H3N2和H1N1三种流感病毒具有保护作用的合成多肽，该多肽为498-520AA的氨基酸，其序列为：CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。

进一步，所述载体蛋白为KLH血蓝蛋白。

上述步骤(2)具体为：

以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到1∶100000，进行终放血，收获血清；

利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进行筛选，其中，

包被液：称取Na₂CO₃ 0.15g，NaHCO₃ 0.293g，蒸馏水稀释至100ml，得到0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存；

洗涤液(稀释液)：称取NaCl 8g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，量取Tween-20，0.5ml，用蒸馏水加至1000ml，即为0.01mol/L pH7.4PBS-Tween-20洗涤液，4℃，保存；

封闭液：5％脱脂奶粉或BSA的pH7.4PBS；

终止液：2mol/L的硫酸溶液；

然后按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型H1N1流感病毒具有特异性的合成多肽，即：

1)包被抗原：用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜；

2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

3)加封闭液200ul，37℃放置1h；

4)洗涤同2)；

5)加抗体：兔免疫血清用封闭液1∶500倍稀释，反应板每孔加100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；

6)洗涤同2)；

7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(1∶1000倍稀释)，反应板每孔100ul，37℃放置1h；

8)洗涤同2)；

9)加底物：加TMB100ml，室温暗处放置15min；

10)加终止液：反应板每孔50ul；

11)观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

本发明多肽合成过程简单快速，而且所得到的多肽偶联抗原就有较广泛的保护作用。对于亚单位疫苗的研制，控制流感病毒的蔓延具有积极的意义。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细说明。

本发明合成多肽的筛选方法包括如下步骤：

(1)肽抗原表位的生物信息学选择与合成、修饰