[发明专利]土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法

说明书

技术领域：

本发明主要涉及微生物的菌剂制备方法，尤其涉及利用食品行业产生的废液制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌三菌组合的液体菌剂的制备方法。 

背景技术：

传统的微生物液体菌剂的制备方法，所用原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、牛肉膏、维生素，无机盐和水配制成液体培养基，从试管斜面菌种上刮取菌苔接种在液体培养基中，经好氧或厌氧培养制备成液体菌剂，其缺点是：所用原料成本高，生产工艺复杂，不能节约能源。 

混合菌剂传统做法，是将各种不同的菌种(好氧和厌氧)在各自不同的生长环境中培养菌种，然后从每个菌种的培养物中刮取菌苔制取每个菌的液体菌悬液，再转种于各自的液体培养液经通气或厌氧发酵培养后离心制取活性细胞菌，将沉淀物喷雾干燥制成粉剂，制成多菌的混合。其缺点是：制备工艺复杂，发酵周期长，成本高，应用受到限制。 

发明内容：

本发明的目的在于避免现有微生物液体菌剂生产技术不足之处而提供一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法。使用巨大芽孢杆菌与胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌科学配伍，以新鲜豆腐或粉丝或玉米或洋芋淀粉产生的废水为原料，添加少量无机盐制备巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂。 

本发明的目的可以通过采用以下技术方案实现：一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂，其主要特点在于由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、圆褐固氮菌(Azotobacter  chroococcum)和液体培养基组成，其三种菌株的重量百分比为巨大芽孢杆菌为55～65％、胶冻样芽孢杆菌为30～35％、圆褐固氮菌5～10％，所述的巨大芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3770；所述的胶冻样芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3769；所述的圆褐固氮菌的保藏号为CGMCC No.3768。 

所述的土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂，所述的液体培养基包括有在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 7.2-7.5。 

一种土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌和圆褐固氮菌液体菌剂的制备方法，其主要特点在于有如下步骤： 

A.土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养： 

a.琼脂斜面培养基的制备：麦芽汁0.5-2％、葡萄糖0.5-2％、蛋白胨0.2-0.6％、琼脂粉1-3％、无菌水80-120ml，加热溶解后，用1％的氢氧化钠调pH值至7.0-7.5，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下分装于15×1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用； 

b.土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌菌种的培养：分别取巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃、24-48小时培养，即得琼脂斜面菌种，为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌一级菌种； 

B.所述土著益生圆褐固氮菌琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养： 

a.琼脂斜面培养基的制备：磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，氯化纳0.01-0.03％，碳酸钙0.4-0.6％，甘露醇0.8-1.2％，硫酸钙0.08-0.12％，琼脂1.8-2.2％，水80-120毫升，加热溶解用1％的氢氧化纳调pH值6.8-7.0，经110-114℃，30-35分钟蒸汽灭菌，然后在无菌条件下，分装于15×1.5cm干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用； 

b.土著益生圆褐固氮菌菌种的培养：取土著益生圆褐固氮菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28-32℃，48-32h，即得琼脂斜面菌种，为圆褐固氮菌一级菌种； 

C土著益生巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、圆褐固氮菌液体培养基的制备及液体菌种的培养： 

a.液体培养基的制备：在1升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或洋芋淀粉废水中加入硫酸铵1-2g，磷酸0.5-1ml，用1％的石灰水调pH 7.0-7.5，分装于 500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112℃，30-35分钟高压灭菌，冷却后备用；