[发明专利]乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗性疫苗及其制备方法，尤其涉及一种乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗。 

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是由HBV引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。为此，寻求理想的抗HBV药物一直是亟待解决的研究课题。目前，慢性HBV感染主要采用抗病毒药物进行治疗，应用的抗病毒药物主要有干扰素和核苷类药物如拉米夫定等，其中，干扰素的适应症有限，疗效较差，不良反应发生率较高，且价格昂贵；拉米夫定作为逆转录酶的强抑制剂，在控制慢性HBV感染方面具有确切的近期疗效，且有良好的耐受性，但其不能清除肝细胞内HBV复制的来源，长期用药又存在耐药问题。因此，积极寻求更为有效的抗病毒药物仍为当务之急。 

CD8+T细胞是机体免疫系统的主要组成部分，在针对病毒、细菌和真菌等病原性微生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗过程中发挥关键性作用。HBV感染的慢性化主要是由于机 体对HBV的免疫应答特别是细胞免疫应答不能清除病原，从而导致感染的持续存在。在急性HBV感染时，机体存在大量的针对HBV多个抗原表位的多特异性、多克隆的细胞毒性T细胞(CTL)应答，而在慢性HBV感染时，这些CTL应答非常微弱甚至检测不到。因此，采取恰当的免疫方式，打破机体对HBV的免疫耐受，重建活跃的免疫应答，有望清除病毒，终止慢性HBV感染。乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是HBV的一种结构蛋白，是机体CTL识别和攻击HBV感染细胞的主要靶抗原。因此，增强HBcAg特异性的CTL应答，有望终止慢性HBV感染。 

但是，HBV的慢性患者存在免疫应答低，特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受等问题，在设计治疗性疫苗时需增强免疫系统对HBV的识别能力以激发有力的特异性细胞免疫。 

树突状细胞(DC)是体内最强大的专职抗原递呈细胞，能够识别、捕获、加工、递呈抗原引发初始免疫反应。利用DC来改善病毒的免疫原性是治疗性疫苗设计的重要策略之一。DC显著的特点是：①为功能很强的专职APC；②可分泌极化信号诱导Th0细胞向Th1细胞分化；③可通过“交叉激活”途径激活CD8+T细胞。因此，若将抗原特异性地靶向DC，定能增强疫苗的疗效。DC表面具有Fc受体，为设计DC靶向性疫苗创造了条件。 

免疫球蛋白G(IgG)Fc片段是抗体恒定区重要的结构域，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位，Fc能介导抗体的多种生物学功能。Fc不仅能够激活补体系统，而且还能介导抗原抗体复合物通过Fc受体与抗原呈递细胞结合，并在受体的介导下促进抗原呈递细胞对外来抗原的吞噬，进而激发机体对特定抗原的细胞免疫反应。由于Fc具有介导细胞的免疫应答反应，所以人们利用Fc片段与特异抗原蛋白进行融合，以促进抗原对抗原呈递细胞的靶向性，提高机体对特异抗原的免疫应答反应，特别是细胞免疫应答反应。研究已证明，在抗原呈递细胞中，通过Fc受体介导内吞的外来抗原，不仅可 以大幅度(1000～10000倍)促进MHCⅡ途径呈递抗原的活性而激活CD4+T细胞，而且还可以通过MHCⅠ交叉呈递抗原作用激活CD8+T细胞。所以用Fc融合抗原可以刺激机体抗原特异性的淋巴细胞毒性反应，所以可被用于病毒的免疫治疗。 

免疫刺激复合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发形成的一种直径为30～40nm的球形笼状颗粒，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可大幅度提高抗原的免疫原性。文献报道，以ISCOM为佐剂制得的DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经ISCOM包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而保证该DNA在机体内持续表达。另外，ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从而有利于抗原递呈细胞的吞噬。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法及其制备的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗。 

本发明还提供上述的乙肝病毒的树突状细胞治疗性疫苗的制备方法，其主要包含步骤： 

1)构建乙肝病毒核心抗原HBcAg与免疫球蛋白G的Fc双基因共表达重组真核载体；