[发明专利]干细胞分化为睾丸间质细胞模型的构建及应用

说明书

技术领域

本发明属发育生物学和药理学领域，涉及一种模型的构建及用途，具体涉及构建干细胞体外定向分化为睾丸间质细胞模型，及其在以调节睾丸间质细胞分泌功能为靶点的诱导分化剂筛选中应用。利用由干细胞分化而来的睾丸间质细胞移植作为一种新的补充睾酮的方法，提高睾丸间质细胞再生和移植的应用前景。

背景技术

男性更年期综合征，即中老年男子雄激素部分缺乏(PADAM)或中老年男性性腺功能减退是当前普遍关注的社会问题。目前临床主要应用化学合成的雄性激素进行替代治疗。然而人体长期应用化学合成雄激素易引起肝功能损害、高血脂症及前列腺癌等并发症，短期过量补充还可引起人情绪不稳等多种副反应。近年来国内外专家尝试开展了近亲供体移植术或干细胞移植术治疗睾丸损失或男性性腺低下症，取得较好效果。但这种移植术存在供体来源有限、手术复杂、经费高等缺点，受者需长期服用免疫抑制剂等。

体内合成分泌睾酮的主要是睾丸间质细胞(Leydig Cells，LCs)，它分布于生精小管之间的疏松结缔组织中，其含量占睾丸细胞数量的2％～4％。主要功能是分泌睾酮，分泌活动受丘脑下部、垂体及自身的调节。鉴于雄激素上述重要的生理功能，调节睾丸间质细胞合成分泌雄激素的因素也越来越受到人们的重视。胚胎干(embryonic stem cells，ES)细胞在体外合适的培养条件下，可以定向分化为各种有限发育潜能的细胞，并可以替代器官中死亡或损伤的细胞并恢复其正常功能。对于睾丸和生殖发育，目前研究的兴趣主要集中于精原干细胞，而对于间质细胞的发育起源研究则相对较少。男性生殖系统来源于中胚层，尚未见由ES细胞定向分化为睾丸间质细胞及其影响分化发育机制相关报道，更未见利用该模型评价调节睾丸间质细胞分泌睾酮功能为靶点的促细胞分化剂筛选。

发明内容：

本发明的一个目的是构建胚胎干细胞(ES细胞)定向分化为睾丸间质细胞模型，主要是将类固醇生成因子1(Steroidogenic Factor 1，SF-1)和促黄体生成激素受体(luteotropic hormone receptor，LHR)质粒共转染入ES细胞，然后用化合物或生长因子诱导ES细胞定向分化为睾丸间质细胞。

本发明所述胚胎干细胞体外定向分化为睾丸间质细胞模型通过以下步骤构建：将ES细胞进行无饲养层培养，按effectene transfection regeagent(Qiagen)(有效转染试剂手册)说明书进行质粒转染；6孔培养板中每孔4×10⁵个ES细胞，并按以下试剂量操作：取两种待转质粒SF-1和LHR各2μg溶于100μl EC缓冲液，再加入16μl增强子enhancer溶液，涡旋1s混匀，室温放置2-5min；然后加入25μl有效转染溶液effectene transfection regeagent，涡旋10s，室温放置5-10min；再加入2.2ml培养液混匀。转染24小时更换培养液后，加入诱导剂，5×10^-7mol/L维A酸(RA)和1×10^-3mol/L 8-溴-环磷腺苷(8-Br-cAMP)共同诱导转染了SF-1和LHR质粒的ES细胞定向分化为睾丸间质细胞；以检测睾丸间质细胞中类固醇合成相关蛋白：类固醇急性调节蛋白(StAR)、血小板生长因子受体(PDGFR)、胆固醇侧链裂解酶P450scc(CYP11A1)和3β-羟甾脱氢酶1(3βHSD1)是否表达和是否具有分泌睾酮功能为评价指标。

本发明的另一个目的是利用上述的ES细胞定向分化为睾丸间质细胞模型在药物(诱导分子)药效初步筛选与评价中的应用。主要可用于在以调节睾丸间质细胞分泌功能为靶点的诱导分化剂筛选中应用。

本发明在细胞层面上对干细胞体外定向分化为睾丸间质细胞模型构建及其应用做了论证，对其中蕴藏的大量生物学信息进行了初步探讨，具体有以下优点：

1.本发明构建了SF-1和LHR共转染入ES细胞，用化合物或生长因子诱导ES细胞定向分化为睾丸间质细胞模型，能作为研究睾丸间质细胞分泌调节功能影响因素研究的替代模型。

2.本发明开拓了干细胞分化为睾丸间质细胞模型的新用途，即可用于以睾丸间质细胞为作用靶细胞的药物药效初步筛选与评价。

3.本发明还开拓了干细胞分化为睾丸间质细胞的另一新用途，即可利用由干细胞分化而来的睾丸间质细胞移植作为一种新的补充睾酮的方法，提高睾丸间质细胞再生替代治疗的应用前景。

附图说明

图1为RA和8-Br-cAMP诱导ES细胞分化为睾丸间质细胞形态。