[发明专利]牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域HGP44基因的克隆重组菌及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域Hgp44基因的原核表达质粒。

背景技术

牙周病是人群中发病率很高的口腔三大疾病之一，在我国人群中发病率高达75％以上。牙周病是由牙菌斑中的微生物引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，主要症状是牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收，最终可导致牙松动和被拔除。牙周病属于慢性感染性疾病，免疫机制在疾病的发展过程中也发挥了重要的作用。

冠心病是目前主要致死性疾病之一，病因机制复杂，传统的致病因素是高血脂、高血压、糖尿病、遗传、吸烟等。近年来越来越多的学者发现动脉粥样硬化(AS)形成过程中常伴随着炎症反应，病原微生物可以侵袭入内皮细胞、平滑肌细胞，激发和促进动脉粥样硬化的炎症反应，由此推测感染可能是冠心病一个重要的致病因子。炎症反应和免疫反应关系非常密切，免疫反应是炎症反应的重要启动因素。

大量的流行病学研究揭示了牙周病和冠心病之间存在一定的相关性，进一步的实验研究提示牙周病主要致病菌牙龈卟啉单胞菌(P.g)在一定程度上促进了动脉粥样硬化形成。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.g)是革兰氏阴性、专性厌氧的产黑色素短杆菌，能产生多种与牙周组织破坏有关的侵袭性因子，主要有内毒素、菌毛、牙龈素等，是目前公认的重要的牙周炎致病菌，也是牙周炎活动性检测的指示菌。投射扫描电子显微镜发现P.g可以侵入人脐静脉内皮细胞。

牙龈素是P.g分泌的胞外蛋白酶，可破坏细胞基质，使宿主免疫调节失衡。目前发现，与牙周疾病关系密切的牙龈素主要有两种：精氨酸特异性蛋白酶(Arginine-gingipains，Rgps)和赖氨酸特异性蛋白酶(Lysine-gingipain，Kgp)，其中Rgps又称卟啉素，分为RgpA和RgpB两种。RgpA和Kgp均为非共价复合物，包一个N-末端前肽区，蛋白水解区和一个C-末端粘附素区(HGP15[HbR]，Hgp17，Hgp27和Hgp44)，具有独立的催化区域和凝集区域。然而RgpB一级结构只有催化区域，其相当于HRgpA的催化亚基。动脉粥样硬化过程伴随有炎症反应，而内皮细胞激活是炎症反应的关键步骤。P.g可以激活内皮细胞黏附分子如细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子的释放，从而有利于中性粒细胞向内皮细胞趋化，促进血管平滑肌细胞的迁移和增殖，促进血细胞的游走以及动脉粥样硬化的形成。Hgp44是牙龈素上一段粘附素区域，Hgp44能够通过粘附到HIV-1gp120蛋白上，阻断HIV-1外膜介导的膜融合，进一步阻断HIV感染。同时，P.g依赖细胞内编码Hgp44粘附素的基因诱导血小板聚集。目前关于Hgp44促进血小板聚集的研究国外报道很少，而国内没有研究报道过。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域Hgp44基因的克隆重组菌，它是Hgp44-pET22b-BL21(DE3)大肠埃希氏菌，其保藏编号为CGMCC NO.3799，其拉丁学名为Escherichia coli。

本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种上述克隆重组菌的构建方法，为此，本发明采用以下技术方案：它包括以下步骤：

1)、通过PCR方法克隆得到Hgp44基因；所述Hgp44基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，PCR扩增的引物为：

上游5`-CCATATGAGCGGTCAGGCCGAG-3`

下游5`-GCTCGAGTGCCGTAATCGTCTCTTC-3`，

2)、通过酶切连接方法将Hgp44基因连接到表达载体pET 22b，形成质粒Hgp44-pET22b；

3)、将构建的Hgp44-pET22b载体转化到受体菌coli.BL21(DE3)中，获得克隆重组菌Hgp44-pET22b-BL21(DE3)。

牙龈卟啉单胞菌诱发机体产生一系列细胞因子引起机体自身免疫反应，并通过RgpA，Kgp和HagA的编码基因，即细胞内编码Hgp44粘附素的基因诱导血小板聚集，促进内膜胆固醇的沉积和血管壁增厚，从而对心血管系统产生严重危害。基于Hgp44在牙龈卟啉单胞菌毒性中具有的意义，本发明利用已发表的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277Hgp44序列，设计引物，采用PCR方法从P.g ATCC 33277全基因组DNA中扩增出Hgp44基因片段，克隆到pMD 18-T载体，经酶切鉴定正确后送测序，测序结果证实与Genbank中牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277Hgp44序列高度同源。