[发明专利]一种基于超滤浓缩的从大体积尿液样品中提取microRNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从大体积尿液样品中提取microRNA的方法。 

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一种21-25nt长的非编码调控单链小分子RNA，主要功能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。已有的研究表明一些miRNA的异常表达与一些疾病或癌症的发生发展相关，而且研究发现miRNA不但在组织细胞中存在，在一些体液如血清、血浆及尿液中也稳定存在，因此，miRNA有望成为一类检测或预测一些疾病或肿瘤的重要生物标志物。 

检测miRNA常用的技术方法是基因芯片和荧光定量PCR，但是这些技术方法的应用前提是对组织、细胞或体液进行核酸提取、纯化后获得miRNA。尿液样品由于获得方便、避免了机体损伤等原因已成为最理想的候选样品，但是由于单位体积尿液中的miRNA含量很低，目前市售的提取试剂盒能够处理尿液样品量较小，无法达到一些大规模筛选或表达检测的实验要求。 

发明内容

本发明的目的是在于解决现有技术的缺陷，提供一种可以从大体积尿液样品中成功提取miRNA的实验方法，以获得纯度和产量均达到适用于一些大规模筛选或检测表达的miRNA。 

本发明另一个目的是提供一种稳定剂的配方，该稳定剂不仅能够稳定尿液中的miRNA不被降解，而且能够裂解尿液中的脱落细胞，使细胞内的miRNA释放出来。 

本发明的稳定剂在尿液样品获得之后立即加入，自然溶解后保存于-80℃冰箱，可保持miRNA稳定，不被降解。 

本发明尿液前处理步骤一中经稳定处理的尿液的pH值接近7.0，稳定剂在尿液样品中异硫氰酸胍的浓度为6mol/l，N-月桂酰基肌氨酸的浓度为0.5mol/l，无水乙酸钠的浓度为0.025mol/l，HEPES的浓度为0.5mol/l，尿液样品终体积为30ml。 

通过采用超滤管(Amicon Ultra-15 3K，millipore)，可将1-30ml的尿液样品浓缩至1ml左右，通过酚/氯仿萃取，再采用市售的试剂盒(miRNeasy Mini Kit，Qiagen)抽提，可获得质量、产量符合要求的miRNA。 

本发明从大体积尿液样品中提取miRNA的原理和优点：1.对尿液样品进行降解酶抑制处理，可长时间保存尿液样品，适合长距离运输而游离miRNA片段不被降解；2.采用超滤浓缩装置对尿液样品进行浓缩，减少了氯仿、苯酚等有毒试剂的使用量，减少了污染，同时由于样品体积的减小，缩短了核酸片段吸附捕获的时间，减小了片段被降解的风险；3.使用氯仿和Tris饱和酚混合溶液抽提，可以有效去除尿液样品中的蛋白质等杂质；4.综上所述，本发明克服了尿液样品保存过程中miRNA片段降解的问题，克服了大体积尿液样品难以处理的问题，能够获得产量、质量均达到后续实验要求miRNA；5.本发明同样适用于含有组织脱落细胞的尿液。 

附图说明

图1为本发明所述方法所提取miRNA的荧光定量PCR实时监测曲线图 

图2为实施例2所述方法所提取miRNA的荧光定量PCR实时监测曲线图 

具体实施方式

通过借助以下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受这些实施例的限制。 

[实施例1] 

利用本发明方法提取尿样中游离miRNA并检测表达。 

尿液样品一份为随机获取，采样对象健康状况未知，具体实施过程如下： 

(1)尿液样品(30ml)获得后立即加入一定量的稳定剂，自然溶解后保存于-80℃或直接进行下一步实验。 

(2)采用超滤管(Amicon Ultra-15 3K，millipore)将尿液样品浓缩至1ml左右，用Tris饱和酚∶氯仿(1∶1)萃取，取上清。再采用市售的试剂盒(miRNeasy Mini Kit，Qiagen)抽提，获得miRNA。 

(3)采用逆转录试剂盒(miScript Reverse Transcription Kit，Qiagen)对获得的miRNA进行逆转录，逆转录条件为：37℃60min；95℃5min。