[发明专利]一种体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白在细胞中的分布及功能分析领域，具体涉及一种体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法。

技术背景

神经氨酸酶(neuraminidase，NA)是构成流感病毒胞膜刺突的一个重要蛋白成分。蛋白质的亚细胞定位是蛋白质功能研究的重要方面，研究发现，NA蛋白在细胞水平上的抗病活性与其亚细胞定位有关。研究NA蛋白的细胞亚定位对该蛋白抗病功能及其抗病机理的研究具有重要的意义。

从目前蛋白定位研究来看，方法主要是免疫组织化学染色技术，它是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或者抗体物质定性和定位的组织化学技术。但该技术是一种多步骤、多因素决定的实验方法，有很多干扰因素，无论是组织取材、固定、制片、抗原暴露及修复、液体及抗体的配制、修复温度、显色等等因素都会影响免疫组织化学染色，对试验结果造成直接的影响。而绿色荧光蛋白目前作为一种荧光标记基因，利用基因工程技术，将该基因整合于感兴趣蛋白cDNA一端使其融合表达蛋白，应用荧光显微镜可方便、快捷的检测到目的基因的表达，从而减少了实验步骤，加快了实验进展。

发明内容

本发明目的是提供一种体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法，该方法能简捷、直观检测外源基因在细胞水平上的表达位置。

本发明所说的体外重组神经氨酸酶的细胞定位方法，可通过以下三个具体步骤来实现：

步骤一：将神经氨酸酶基因的cDNA(Genebank登录号：EU429718.1，具体序列如SEQ NO.1所示)。连接进真核表达载体pcDNA3.0，构建pcDNA3.0-NA载体，然后再将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因连接至pcDNA3.0-NA载体上，构建融合表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA；

步骤二：将含有绿色荧光蛋白(EGFP)基因与神经氨酸酶的融合表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA转染NIH-3T3细胞；

步骤三：转染细胞48h后，荧光倒置显微镜下可观察绿色荧光在细胞水平上的表达位置，以此可确定神经氨酸酶在细胞中亚定位情况。

由于神经氨酸酶具有酶切活性，可以酶切去掉细胞表面的唾液酸受体，使细胞免受粘病毒(如：禽流感病毒、新城疫病毒等)的侵染。把某一亚型的NA基因cDNA构建表达载体导入小鼠3T3(NA-)细胞系中构建能够永久表达NA基因的转基因细胞系，细胞水平上的抗病毒实验表明，NA具有一定的抗病毒活性。

NIH-3T3细胞株是从小鼠胎儿里得到培养建立的，由于它显示出强烈的接触抑制作用，所以能明确地识别已发生转染的细胞。该细胞自身不能合成并表达NA蛋白，同时能在体外环境中长期的稳定培养，因此能够作为一种重要的细胞材料满足于生物医学研究的需要。并且经实验表明，连接在一起的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因-NA蛋白基因能在NIH-3T3细胞中正常翻译，因此，本发明利用增强型绿色荧光蛋白基因与NA基因构建融合表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA，该载体在NIH-3T3细胞获得表达，通过检测融合表达蛋白在细胞水平上的表达位置，建立了快速、简捷定位神经氨酸酶的方法。

附图说明

图1：pMD-19T-NA载体构建图

图2：pcDNA3.0-NA载体结构图

图3：融合表达载体pcDNA3.0/EGFP-NA结构图

图4：荧光倒置显微镜下观察EGFP-NA融合蛋白在NIH-3T3细胞中明场(a)、暗场(A)分布

具体实施方式：