[发明专利]一种抗菌肽plectasin的高效生产方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽的表达技术，尤其是涉及一种真菌防御素抗菌肽plectasin的高效生产方法及应用。

背景技术

目前，几乎所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着动物和人类的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。抗菌肽是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，是一种由微生物、植物、无脊椎动物和各种动物的细胞和组织产生的一种抗菌活性多肽，也是生物体内先天免疫系统中的重要组成部分。现有技术研究发现抗菌肽广泛分布于细菌、昆虫、植物、两栖动物和哺乳动物中，它具有广谱抗菌、抗病毒、杀肿瘤细胞、热稳定、强碱性、易溶于水和带正电荷等特点，相对分子质量低及对真核细胞几乎没有毒不良反应。并且抗菌肽的抗菌所需浓度小，抗菌浓度单位一般在μmol/L水平，可作为传统抗生素的替代品，具有巨大发展潜力。

Plectasin是2005年Mygind等研究小组从腐生子囊菌(thesaprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella)中分离得到首例真菌防御素，其研究结果公布在《自然》杂志上，(Nature，2005，437：975-980)。Plectasin具有有效的抗革兰氏阳性菌且无溶血性等功能，是一种具有治疗潜能的肽抗生素。

Plectasin基因开放阅读框编码一个95个残基长的肽，由一个信号肽序列(残基1-23)，一个前片断(残基23-55)和一个40个残基的C端区域(残基56-95)，与几种无脊椎动物防御素存在50～55％序列相似性，其分子量约为4.4KD。

直接从腐生子囊菌菌丝体中提取天然Plectasin时，分离提纯存在一定的困难，而且产量有限。化学合成和基因工程法是获得抗菌肽Plectasin的主要手段，但化学合成Plectasin成本高，而通过基因工程在微生物中表达抗菌肽基因是获得Plectasin的有效途径。Mygind等2005年从P.nigrella菌丝体中克隆到Plectasin的cDNA，将其转化将到Aspergillus oryzae表达系统中，分泌出Plectasin，并进行了其结构和活性研究。

大肠杆菌表达系统基于大肠杆菌的原核表达系统是迄今在基因工程领域中应用最多、也最完善的系统，但运用该系统表达抗菌肽则遇到很多困难，主要表现在2个方面：一是抗菌肽的宿主细胞毒性，宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性地抑制宿主细胞的增殖，从而影响抗菌肽的进一步表达；二是容易被降解。由于抗菌肽本身带有大量正电荷，因而对蛋白酶非常敏感，在表达胞中容易被降解，难以实现大量表达。而且大肠杆菌表达产物均以包涵体的形式存在，需将细胞超声破碎后透析纯化，给后续处理带来困难。

抗菌肽Plectasin的现有表达技术同样存在上述问题，表达量较低，纯化操作繁琐。

酵母表达系统具有与大肠杆菌同样的繁殖快、易于培养、遗传操作简单、可工业化生产等特点，酵母表达系统同时还具有使蛋白折叠、磷酸化、糖基化、酰胺化等修饰能力，避免了蛋白以包涵体形式表达、活性降低等问题。

但目前抗菌肽的酵母表达系统基本上是基于甲醇诱导，存在着较多技术问题，如某些蛋白的表达量相对较低甚至不能表达；分泌表达产物不均一，存在聚合体、信号肽加工不完全、表达产物降解等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术抗菌肽Plectasin生产技术的不足，筛选得到更适合抗菌肽plectasin的表达系统，并寻找到获得高效表达结果的技术方案，提供一种抗菌肽plectasin的高效生产方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种抗菌肽(真菌防御素)plectasin的高效生产方法，包括以下步骤：

(1)将编码plectasin的DNA序列克隆到载体pGAPZαA上，构建pGAPZαA-plectasin重组表达载体；

(2)将重组表达载体pGAPZαA-plectasin转化宿主细胞毕赤酵母SMD1168，构建重组酵母基因工程菌；

具体操作方法是：将感受态P.pastoris SMD 1168与Avr II线性化的pGAPZαA-plectasin相混合，将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板上，培养至单菌落出现。采用煮—冻—煮法制备PCR模板分析P.pastoris转化子，设计引物扩增出391bp的克隆子定为阳性转化子，添加不同浓度Zeocin的YPD平板筛选酵母表达子；