[发明专利]一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株。

背景技术

阿维菌素(avermectin，AVM)是一种由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的大环内酯类抗生素，它有八个组分(A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a，B2b)，其中B1a组分的杀虫活性最强，对线虫、螨虫和节肢动物具有良好的杀灭作用，杀虫活性比一般化学农药高出几十倍。阿维菌素的作用机理与常规化学杀虫剂不同，它的作用靶点是线虫及节肢动物类寄生虫的神经传导介质γ-氨基丁酸(GABA)，对哺乳动物的毒性很小，选择性极高。该抗生素在植物中残留时间很短，并且在土壤中很快被微生物分解为无毒物质。由于阿维菌素的这些突出的优点，其被公认为是一种最为安全有效的微生物来源的杀虫剂，因此它在农业、林业、医药和兽用上具有非常广阔的市场前景和应用价值。同时以阿维菌素为母体，还可以开发出一系列活性更高、选择性更强、使用更加安全的衍生新品种，已商品化的品种包括伊维菌素、埃玛菌素、多拉菌素、埃珀利诺菌素和塞拉菌素等。此外，近年来又有研究者发现阿维菌素有抗肿瘤的功效，并且对肿瘤细胞的抗药性也有一定的抑制作用。

目前，阿维菌素已在国内实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但我国阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题，如何提高阿维菌素的产量，降低生产成本，将为我国的农业生产发展起到促进作用。此外，不仅是阿维菌素，如何筛选和优化菌株、使产率和原料利用率实现最大化是我国微生物发酵工程面临的普遍问题。目前用于提高链霉菌的抗生素产量的方法主要包括两大类，一类是传统的诱变育种方法，通过物理化学方法对菌株进行诱变，然后在诱变后代中筛选高产菌株；另一类是通过遗传学的方法，对菌株进行直接的遗传改变，提高抗生素的产量。通过物理化学方法对菌株进行诱变虽然已经取得了一定的成绩，得到了大量的高产菌株，但它们的不足之处也很明显，主要包括耗费大量人力、物力和时间，筛选工作比较复杂，存在一定盲目性，在引入有利变异的同时可能也会产生很多有害的变异，而有害的菌种变异往往会影响发酵过程的优化和放大；这些传统的菌种选育方式由于对引起功能变化的生物学基础不了解，因此较难推广应用于其他菌种。随着细菌基因组研究的不断深入，对细菌基因功能的认识不断深刻，人们越来越倾向于用遗传学手段对菌株进行改造。用遗传学的方法可以将功能已知的基因进行改造，增强了操作的针对性，而且使工作量大大降低，筛选时间也得到缩短。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维菌素的产量，具有重要的意义。

2001年Kitasato研究所完成了阿维链霉菌的基因组测序，对其中负责阿维菌素生物合成基因簇进行序列和功能分析，该基因簇全长82kb，共有18个开放阅读框架。基因簇内部有4个大的阅读框架(AveA1-AveA2和AveA3-AveA4)，编码多功能的聚酮体合成酶；aveC和aveE基因位于aveA1-aveA2和aveA3-aveA4基因之间，与聚酮体的修饰有关；在基因簇的右侧邻近aveA4的上游，是一套涉及齐墩果二糖的合成和转移的8个基因(aveB I-aveBV III)；紧邻aveA1的上游(左方)是编码C5-O-甲基转移酶的aveD，负责将甲基转给阿维菌素B的C5的OH上而形成阿维菌素A。aveF紧邻aveD的下游，二者转录方向一致，可能属于同一转录单位。aveF编码C5酮基还原酶，催化阿维菌素B的生成。aveR位于aveF的下游(但转录方向相反)，属于途径特异性调控基因，是阿维菌素生物合成全基因簇的正调控基因。

在抗生素产生过程中基因水平的分子调控起着至关重要的作用，通过遗传学方法对链霉菌进行改造，提高抗生素产量。主要是通过改造抗生素产生的调节基因来进行的，有既与抗生素生物合成相关又与形态分化相关的调控基因，如bldA，relC，relA等；也有参与抗生素生物合成的全局性调控基因，如absA，absB，afsR等；还有参与抗生素生物合成的特异性调控基因，如ActII-ORF4，aveR，dnrI，redD，sanG，ccaR等。对抗生素生物合成起正调节作用的基因，可以通过提高它在菌株中的拷贝数或者改变启动子提高其表达量来提高抗生素的产量，对起负调节作用的基因，则可以通过敲除该基因来提高抗生素的产量。但是，通过提高拷贝数的方法得来的菌株往往稳定性较差，因为高拷贝的遗传载体往往不稳定，容易丢失，若考虑到后期的工业生产，可能更多尝试通过同源重组整合到染色体上，更加稳定的维持高产相关基因在工程菌株的稳定存在。对能同时调控多种抗生素产量的调节基因进行改造比改造只调控单一抗生素产量的调节基因更加有效。