[发明专利]一个新的棉花基因PSP231及其启动子

说明书

技术领域

本发明涉及棉花基因。具体是一个新的花粉特异表达的基因PSP231及其启动子的克隆与功能鉴定。该基因涉及到细胞分裂的调控，在棉花花粉发育过程中起着非常重要的作用。

背景技术

长期以来，棉花是我国重要的经济作物，棉花生产不仅与我国农民的收入直接相关，还关系到纺织工业的健康发展和约2000万纺织工人的就业。随着工业发展和人民生活水平的提高，人们对高质量纺织品的需求量逐步增大。因此，纺织及相关行业在对棉花的需求量增加的同时，对棉纤维品质也有了更高的要求。目前我国原棉年产量基本能够满足纺织工业的需要，但纺高档纱的原棉仍然十分缺乏。另外，在我国，棉花种植过程中农药和化肥使用量偏高，既增加了生产成本，造成了环境污染，也给棉花产品的质量安全带来了隐患。因此，培育高产、抗虫、优质的棉花品种对于促进农业和纺织工业及相关产业的可持续性发展有着重要的作用。

杂种优势是生物界的普遍现象，利用杂种互补效应实现多种优良性状相互组合，是改良作物的重要途径之一。随着棉花高产、优质、抗逆、抗虫等多目标育种的难度增加，利用杂种互补现象进行杂交育种已经成为棉花育种的一个重要发展方向。因为棉花花期长，尚未找到在大田制种中比较有效的化学杀雄剂，所以目前我国生产上大面积推广的杂交种，仍然以人工去雄授粉为主。该方法用工多，制种成本高，在很大程度上限制了棉花杂种优势的利用。因此，通过遗传工程抑制雄性发育相关基因的表达来培育棉花雄性不育系，则可以实现高效率、低投入的棉花杂交育种。而此工作的开展则依赖于棉花雄性生殖发育相关基因及其调控元件的识别与分离。通过克隆棉花花药发育的关键功能基因和核心调控元件，分析基因的表达调控及表达产物的生物学功能，阐明花药发育的分子机制，为培育棉花雄性不育系提供理论依据和基因元件。在利用遗传工程创造新的雄性不育系时，特异性启动子也是重要的功能元件，它决定着基因表达的时间、地点和强度。在培育雄性不育系中，一般选择花药特异性启动子控制目的基因表达，这样可以使外源基因在花药中充分表达，同时还可避免目的基因对其他组织生长发育的干扰。因此，高特异性、高活性的启动子和功能基因的克隆与鉴定是棉花分子育种的重要研究内容。

植物的花粉发育是一个复杂而高度程序化的过程，其中受到很多基因的调控。在过去的十多年里，发现了大量的花药或花粉特异表达基因，它们通过不同的途径在花粉发育过程中发挥作用。其中有些基因影响花药中生殖细胞和营养细胞的分化；有的控制绒粘层和胼胝体的退化、降解；有的控制花药的开裂和花丝的伸长；有的调控花粉母细胞的减数分裂和小孢子的两次有丝分裂；还有的影响花粉内外壁的形成和花粉的成熟。这些资料证明植物花药与花粉相关基因及其调控元件(即启动子)在控制花药与花粉发育上具有决定性作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一个新的棉花花粉特异的基因PSP231及其启动子，分析揭示基因和启动子表达活性与功能，探索其对花药发育调控的分子机制，进而应用该基因元件创造棉花雄性不育系。

在本研究中，申请人从棉花花药cDNA文库中分离获得1个花粉特异性基因PSP231。PSP231 cDNA包含1656bp的开放阅读框架，编码一个551氨基酸的新蛋白。PSP231蛋白分子量为61.74KD，等电点(pI)为8.99，蛋白序列比对分析结果显示该蛋白是一类新的花粉特异性蛋白，含有两个铜离子结合结构域，可能属于抗坏血酸氧化酶家族的同系物。利用RT-PCR技术，验证了该基因的表达谱，表明该基因在棉花花药中特异表达，而在其他组织中未检测到该基因的mRNA(见图1)。进一步研究表明，该基因在棉花花药发育中期，花蕾发育约15天开始表达，并且随着花药发育成熟，该基因的表达量逐步升高，在开花当天表达量达到最高(见图2)。RNA组织原位杂交实验显示，该基因仅在花药发育中后期的雄配子体细胞中表达，在孢子体细胞中不表达(见图3)。

为获取PSP231基因的基因组DNA全长序列，申请人在其开放阅读框(ORF)两端设计一对引物，以棉花基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得该基因的DNA全长序列，与其cDNA序列比较分析发现该基因含有两个内含子，长度分别为96和82bp，第一个内含子插入在第83密码子内，第二个内含子插入在第452密码子内(见图4)。