[发明专利]霍乱灭活口服疫苗效力的测定方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法及其检测试剂盒，确切讲本发明是一种用于检测霍乱灭活口服疫苗效力指标的检测方法，和这种检测方法所使用的检测试剂盒。

背景技术

由于人们越来越认识到肠道局部的粘膜免疫应答在预防霍乱感染中的重要性。霍乱口服灭活疫苗的研究也逐渐受到重视。二十世纪八十年代初人们正式开始了对口服霍乱疫苗的研究，先后研制出了单纯全菌体死疫苗(WCV)和全菌体加霍乱毒素B亚单位疫苗(WC/BS)。为确保霍乱疫苗的质量和安全性，在疫苗制备出后必须进行检测，以确定其效力。现阶段采用的霍乱口服灭活疫苗效力检测的方式是通过非肠道给药的家兔免疫原性试验，测定疫苗免疫动物后的抗体效价水平，以及采用小鼠免疫后的半数有效剂量(ED₅₀)方法，上述方法均受动物自身条件的影响，无法正确反应出一次剂量后的免疫应答，试验结果无一致性和重复性。此外这种方法还存在试验成本大、试验时间周期长的不足。世界卫生组织(WHO)于2002年发布了《口服霍乱灭活疫苗的生产及检定准则》一文，文中指出，对霍乱疫苗保护力的评价目前尚无国际公认的直接方法，同时也没有能衡量和预测疫苗对人群的作用的动物模型。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的，其效果能与现采用的试验方法效果一致的检测霍乱灭活口服疫苗效力指标的方法，本发明的另一个目的是提供这种方法使用的检测装置。

本发明的方法是分别从霍乱弧菌O1群菌株和O139型菌株提取脂多糖(LPS)，以O1群和O139型菌株的LPS为抗原，或者以抗O1LPS、O139LPS的兔抗体为抗体，采用间接酶联吸附试验半定量测定霍乱灭活口服疫苗中霍乱O1群和O139型的LPS含量，根据所测得的霍乱灭活口服疫苗中O1群和O139型的LPS含量范围来确定疫苗的效力。

本发明优选的测定方法是以霍乱弧菌O1群和O139型菌株的LPS为抗原，采用间接ELISA法测定霍乱灭活口服疫苗的效力指标。

本发明具体的一个测定方法是：

a.从霍乱弧菌中分离出霍乱O1群菌株和非O1群O139型菌株，再分别从所得到的O1群菌株和O139型菌株中提取O1群霍乱弧菌LPS和O139型霍乱弧菌LPS，标化后将所得到的O1群霍乱弧菌LPS和O139型LPS分别用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，将霍乱O1 LPS参比品稀释为10μg/ml、O139 LPS稀释为2.5μg/ml，再将稀释后的O1LPS和O139LPS分别包被于固相载体上，每孔0.1ml，O1脂多糖和O139脂多糖各加一行。酶标板可以为聚苯乙烯或聚乙烯酶标板。

b.将被检疫苗用PBS稀释为5×10⁷菌/ml，每孔包被0.1ml，以上述霍乱O1LPS和O139LPS的包被孔为参照，，再在其中加入经稀释的兔抗鼠IgG-HRP，即按常规间接ELISA法进行操作，最后加入显色底物，37℃放置5-7分钟，加入2M硫酸终止反应，测定OD₄₅₀的吸光值，根据LPS参照孔和疫苗试验孔的OD₄₅₀数值进行对比，得以判断被检疫苗的效力。

以前述的方法进行霍乱灭活口服疫苗效力的测定方法使用的检测试剂盒以下内容组成：

a.孔酶标板，最好采用96孔酶标板

b.霍乱弧菌O1群菌株LPS和O139型菌株LPS

c.酶标抗抗体

d.底物A

e.底物B

f.酶标洗液

g.终止液。

本发明的试剂盒中优选采用96孔聚苯乙烯或聚乙烯酶标板，底物A优选采用四甲级联苯二胺(TMB)；底物B优选采用过氧化氢(H₂O₂)；终止液优选采用2M的硫酸。在具体使用中应将酶标洗液按10×稀释。

由于本发明不使用动物进行试验，因此不存在受动物自身条件的影响，结果具有一致性，其次，采用本发明试验成本较低，其试验所需时间较短。

附图说明

附图1为间接ELISA标准曲线与O1菌群检测曲线，附图2为间接ELISA标准曲线与O139菌群检测曲线.

具体实施方式

以下为本发明的实施例。

一、材料

1.脂多糖(LPS)的制备：

1.1 O1 LPS采用热酚法用Vibrio cholera O1 18001、569B提取纯化所得。

1.2 O139 LPS为热酚法用Vibrio cholera O139提取纯化所得。

2.血清