[发明专利]表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用。

背景技术

JE(乙型脑炎)也称日本脑炎(Japanese encephalitis)，是由JEV(日本脑炎病毒)引起的人和动物共患的一种虫媒病毒性疾病。主要引起母猪出现繁殖障碍如流产、早产、死胎、木乃伊胎)，也可引起公猪的睾丸急性炎症反应或不育，从而给我国养猪业造成了巨大的经济损失。

JEV属于黄病毒科，黄病毒属，是不分节段的单股正链RNA病毒。基因组长约11Kb，有单一开放的阅读框，能编码、翻释、加工成3种结构蛋白(囊膜蛋白E、膜蛋白M以及衣壳蛋白C)和7种非结构蛋白。E糖蛋白是JEV主要的免疫原，可诱发机体产生中和抗体和血凝抑制抗体，保护机体免受病毒攻击，是乙脑病毒的基因工程疫苗研究首选蛋白。

JEV是目前严重威胁养猪业发展的一种重要的病毒，目前对这JE疾病的控制尚无切实有效的方法，防制JE的疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，但由于免疫原性和安全性等方面的问题受到限制。因此发展新型疫苗来控制JE已是当务之急。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种重组杆状病毒及可作为预防JE感染的亚单位疫苗。

本发明提供的一种表达JEV免疫原基因的重组杆状病毒，带有SEQ IDNO.1所示的序列。所述重组杆状病毒表面展示JEV结构蛋白E。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒的制备方法，步骤包括：

a、制备E基因。制备方法为：用PCR方法扩增了JEV陕西株E基因，并将其克隆到pMD18-T载体，构建了pMD18T-E质粒；

b、将JEV的E基因，插入到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC的p10启动子下游，构建含JEV的E基因的重组杆状病毒转座质粒pBacSC-E；

c、将上述重组杆状病毒转座质粒pBacSC-E转入大肠杆菌内进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA。作为优选，所述大肠杆菌为感受态大肠杆菌DH10Bac。

d、将步骤c得到的重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒。优选地，将重组杆状病毒DNA通过脂质体介导方法转入昆虫细胞Sf9中，包装出重组杆状病毒。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒在制备预防猪乙型脑炎的疫苗中的应用。

本发明提供一种制备预防猪乙型脑炎的亚单位疫苗的方法：重组病毒接种昆虫细胞，培养48～72h，收取感染细胞，-40℃/37℃冻融，离心，取上清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到10⁹PFU/ml。上述昆虫细胞优选Sf9昆虫细胞。

本发明的优点和积极效果为：

1、本发明得到的重组杆状病毒BacSC-E可表面展示JEV结构蛋白E，直接经过超速离心得到杆状病毒的同时也就得到了目的蛋白，可以避免现有技术中表达系统(包括传统的杆状病毒表达系统)表达目的蛋白分离纯化的繁琐过程。而，现有技术的表达系统中表达的目的蛋白是分泌到Sf9细胞的培养基中，需要通过蛋白纯化系统来纯化目的蛋白，这样费时费力，代价昂贵，不能大规模应用于目的蛋白的规模化生产，这也是目前蛋白表达最令人头疼的地方。

2、转座载体中添加eGFP基因，可以通过荧光显微镜直接观察荧光的有无来检测重组病毒的产生情况，大大简化病毒滴度的测定。

3、该重组杆状病毒表面展示的蛋白可与JEV抗体发生特异性反应。

4、本发明得到的一株重组杆状病毒BacSC-E可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫。

5、本发明得到的一株重组杆状病毒BacSC-E对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。

6、本发明得到的一株重组杆状病毒具有很好的遗传稳定性，经多次传代后外源基因不丢失。

7、本发明所使用的目的基因为JEV(自陕西分离)国内分离株，从而构建的重组杆状病毒可作为我国预防JE的亚单位疫苗。

附图说明

图1是重组转座质粒pBacSC-E构建流程图。

图2是重组病毒BacSC-E感染Sf9细胞绿色荧光蛋白的表达。

图3是共轭聚焦显微镜分析重组杆状病毒BacSC-E的E蛋白在Sf9细胞膜上的展示。

图4是重组杆状病毒BacSC-E的E蛋白的Western blot分析。

图5是免疫电镜分析E蛋白在重组杆状病毒BacSC-E囊膜上的展示。

图5中标号说明：A.重组杆状病毒BacSC-E；B.阴性对照组，重组杆状病毒BacSC。

具体实施方式