[发明专利]一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种评价抗朊病毒药物作用效果的方法，特别是在活细胞内利用FRAP技术精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。

背景技术

朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害。关于朊病毒的分子致病机理和治疗药物筛选、开发的研究是国际上生物学、医学领域研究的前沿和热点。全世界的研究者们正致力于寻求抗朊病毒药物筛选的细胞模型的研究，从而尽快研发出预防和治疗朊病毒引发疾病的药物。目前基于酵母细胞的抗朊病毒药物筛选常用的方法是利用颜色变化来评价药物的作用效果，或者进一步利用SDS-PAGE/Western Blot技术在蛋白质水平通过检测朊病毒蛋白聚集体的状态变化来实现。通过颜色变化评价药物的作用效果，大部分时候比较准确，但会出现假阳性和假阴性结果。SDS-PAGE/Western Blot技术可以检测朊病毒蛋白聚集体的存在状态(聚集或可溶)但是检测过程繁琐费时，关键是不能定量检测朊病毒蛋白聚集体大小的变化，而聚集体的大小的变化是抗朊病毒药物作用效果的重要指标。

发明内容

为了解决上述问题，本发明采用荧光漂白恢复技术(Fluoresceneredistribution after photobleaching，FRAP)在活细胞内精确定量检测经药物作用后酵母朊蛋白聚集体的大小，解决了利用颜色变化评价药物作用效果的不稳定和SDS-PAGE/Western Blot技术不能精确定量朊蛋白聚集体大小的技术问题。

本发明使用的菌种为野生型酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae)，来自于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为208719。这种野生型酿酒酵母细胞带有[PSI⁺]朊病毒，即Sup35p呈聚集状态，表现为较大的分子量，菌落颜色表现为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，不同的药物促进Sup35p聚集体解聚的能力不同，从而表现出不同的分子量，菌落的颜色也随着聚集体的变化而变化——Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次表现为白色，粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的分子量(约为74kDa)，菌落颜色表现为红色，称为[psi^-]细胞。

本发明的技术方案是将荧光标签GFP(绿色荧光蛋白)插入SUP35的N和M结构域中间，而不影响朊病毒的聚集及传播，在共聚焦荧光显微镜下可以观察活细胞朊病毒蛋白发出荧光。共聚焦激光扫描荧光显微镜FRAP技术是借助高强度脉冲式激光照射带荧光细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，通过低强度激光扫描，可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向被照射区域扩散的速率，荧光分子扩散的速率与该分子的大小，荧光分子的分子量越大，扩散速率越慢；荧光分子的分子量越小则扩散速率越快。通过比较不同细胞光漂白区域荧光强度恢复快慢，可以定量的比较荧光蛋白质分子的大小。朊病毒蛋白Sup35p聚集时，分子量大，荧光漂白后的恢复速率相对较慢，而朊病毒蛋白Sup35p被药物治愈后变成可溶状态，分子量变小，荧光漂白后的恢复速率则较快。因此可利用共聚焦激光扫描荧光显微镜FRAP技术在蛋白质水平检测药物对朊病毒作用的效果

本发明采用的技术方案是：一种在活细胞内精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法，其步骤如下：

1)[GPSI⁺]酵母细胞的制备：

将荧光标签GFP基因插在野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，ATCC，208719)朊病毒[PSI⁺]的编码基因SUP35的N和M结构域中间，得到荧光标记[PSI⁺]朊病毒的[GPSI⁺]酵母细胞；

2)[GPSI⁺]酵母细胞的活化：

将[GPSI⁺]酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃振荡过夜培养，然后调整[GPSI⁺]酵母细胞悬液OD₆₀₀＝0.2；

3)抗朊病毒药物的初筛选：