[发明专利]逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的制备方法以及活性检测，特别是逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测。

背景技术

(1)逆转肾纤维化治疗相关研究及存在的问题：

肾脏纤维化是不同病因(包括炎症、损伤、药物、糖尿病和遗传因素、衰老等)所导致慢性肾脏疾病的最终共同结局。各种进展性肾脏疾病，无论其原发病如何，最终都将导致肾脏纤维化，进展为终末期肾功能衰竭，并必须依靠透析或肾移植维持生命。因此，研究肾脏纤维化的发病机制、探索能够缓解肾脏纤维化进程或逆转肾脏纤维化的有效治疗手段、延缓终末期肾衰的发生是肾脏疾病研究领域亟待解决的重要临床问题。

随着对肾脏纤维化发生的分子机制逐渐深入，发现转化生长因子β1(Transforminggrowth factor-β1，TGF-β1)和骨形态发生蛋白(bone morphorgenic protein，BMP)及其下游的smad信号转导通路在肾脏纤维化发生发展中起着决定性作用。因此，通过阻断TGF-β1信号转导通路和(或)增强BMP7信号来逆转或延缓肾脏纤维化成为当前研究的热点，并已在大量的体外及动物实验中得以证实。然而，目前阻断TGF-β1信号转导通路多借助于基因治疗，因其需要载体介导，可控性差，转导效率有限，安全性低等问题以及可能加重肾脏炎症反应而难以被临床所接受。而激活BMP7信号转导通路要求BMP7使用剂量非常高，且重组BMP7价格昂贵，使得应用重组BMP7治疗肾脏纤维化也难以在临床广泛使用。因此，开发一种新的能有效阻断TGF-β1信号转导通路，且安全性高，毒副作用小的蛋白药物，将为临床防治肾脏纤维化带来新的希望。

(2)肾脏纤维化治疗的研究进展

目前尚未有能够应用于临床的肾脏纤维化有效治疗手段。在临床前研究中阻断TGF-β1信号转导通路和激活BMP7信号转导通路却都能有效缓解肾脏纤维化并加速转归。

①阻断TGF-β1信号转导通路缓解肾脏纤维化

使用TGF-β1反义核酸、TGF-β1特异性小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)、II型TGF-β受体特异性siRNA和II型TGF-β受体胞外区均可在单侧输尿管梗阻等模型动物抑制肾脏进行性间质纤维化。使用反义核酸封闭TGF-β1下游产物CTGF表达也可明显缓解肾脏纤维化。

使用TGF-β1受体ALK5抑制剂IN-1130治疗大鼠单侧输尿管梗阻肾脏纤维化模型可显著降低TGF-β1mRNA、I型胶原蛋白mRNA和磷酸化smad2蛋白水平、羟脯氨酸含量和肾脏胶原蛋白总含量，并可下调α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和纤维连接蛋白表达，从而抑制肾脏纤维化进程。

以上资料表明阻断TGF-β1信号转导通路可以达到治疗、缓解肾脏纤维化的目的。

然而反义核酸和siRNA在体内稳定性较差；可溶性受体胞外区空间结构复杂，必须采用基因治疗手段给药；ALK5抑制剂IN-1130仅能抑制smad3磷酸化，不能高效阻断TGF-β1信号转导通路。还有研究显示TGF-β1是个双刃箭，它另有较强的抗炎症和免疫调节作用。使用TGF-β1转基因小鼠制备梗阻性肾病和糖尿病性肾病模型发现肾脏炎症显著减轻，其机制为TGF-β1通过上调smad7诱导IκBα表达并进一步阻断NFκB激活。深入研究发现，过度表达smad7可抑制smad2/3激活，从而可以阻止TGF-β1、血管紧张素II等诱发胶原蛋白产生，并可在多种动物模型，包括梗阻性肾病和糖尿病性肾病显著缓解和抑制肾脏纤维化的发生发展。根据这些研究结果我们不难看出目前已经建立的阻断TGF-β1信号转导通路的策略在抑制肾脏纤维化的同时也对机体对抗肾脏炎症的作用通路产生了抑制作用，因此难于在临床推广应用。

②BMP7在治疗肾脏纤维化中的应用

1997年Vukicevic等人报道使用剂量250ug/kg的BMP7可显著减轻缺血再灌注诱发的大鼠急性肾小管坏死并加速肾小管再生。2000年Hruska等发现使用剂量300ug/kg的BMP7治疗单侧尿道完全梗阻所致梗阻性肾病大鼠模型，可明显抑制肾小管萎缩和间质纤维化。2003年Zeisberg等发现使用剂量300ug/kg的BMP7治疗MRLlpr/lpr狼疮性肾炎小鼠和COL4A3-/-奥尔波特综合征小鼠也可显著抑制肾小管萎缩和间质纤维化，此后又发现相同剂量的BMP7可显著加速急性肾小球肾炎小鼠模型肾小管间质性损伤回归。