[发明专利]一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法

权利要求书

1.一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法，其特征在于同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法按照以下步骤进行：一、对环境样本采用DNA抽提试剂盒提取样品中环境微生物的总DNA，然后针对硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因和反硝化的特异基因nis K基因的序列，采用两套特异性引物，进行PCR扩增得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；二、步骤一中扩增出的能同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌进行分离培养、纯化培养和富集培养，即得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液A；三、菌液A采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅰ；四、细菌Ⅰ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的菌液B；五、菌液B采用两套特异性引物对菌液中细菌的 DNA进行PCR扩增，然后进行电泳检测，将同时能够扩增出亚硫酸还原酶基因和nis K基因条带的菌液确定为同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌Ⅱ；六、细菌Ⅱ经过分离培养、纯化培养和富集培养得到纯菌株即为同时用于硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌；其中步骤一、步骤三和步骤五中进行PCR扩增的两套特异性引物均为：第一套硫酸盐还原的亚硫酸还原酶基因的上游引物为5'- AC[C/G]CACTGGAAGCACG-3'，下游引物为5'-TGCCGAGGAGAACGATGTC-3'，第一套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、56℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min，PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的浓度为0.3mmol/L 的dNTPs、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E和2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品组成；第二套反硝化的特异基因nis K基因上游引物为5'- TCACACCCCGAGCCGCGCGT-3'，下游引物为5'-AGKCGTTGAACTTKCCGGTCGG-3'，第二套引物对应的PCR扩增程序为：94℃预热5min、94℃变性30s、55℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min， PCR扩增的反应体系由2μL的10×PCR Buffer、2μL的浓度为0.3mmol/L的dNTPs、1μL的浓度为0.1μmol/L的上游引物、1μL的浓度为0.1μmol/L的下游引物、0.3μL的浓度为0.3U/μL的rTaq E、2μL的浓度为2μg/L 的DNA样品和20μL的dH₂O组成。

2.根据权利要求1所述的一种同时进行硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌的分离方法，其特征在于步骤二和步骤四中的分离培养方法均为：待分离的厌氧细菌接种于液态培养基中，采用亨盖特厌氧滚管技术进行分离培养，然后对分离培养得到的菌株进行检验，筛选出同时硫酸盐还原和反硝化的厌氧细菌，其中，培养温度为35~38℃，培养时间为7~12天；液态培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5；亨盖特厌氧滚管技术中所使用的固体培养基由4g Na₂SO₄、2.0g KNO₃、2.0g NaNO₃、1g MgSO₄·7H₂O、0.5g K₂HPO₄、5g酒石酸钾钠、1.0g KH₂PO₄、0.2g CaCl₂·2H₂O、12g琼脂和1750mL蒸馏水组成，pH为7.5。