[发明专利]一种棘孢木霉菌的筛选方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及真菌的筛选方法及其应用，尤其涉及棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)的筛选方法及其应用。

背景技术

砷是一种在自然界广泛存在的有毒并且致癌的非金属元素，砷污染已成为全球危害十分严重的环境问题之一。据报道，全球至少5000多万人口正面临着地方性砷中毒的威胁，其中大多数为亚洲国家，中国是受砷中毒危害最为严重的国家之一，在1956-1984年二十多年间，中国曾发生过30余起地砷中毒事件。我国是砷矿大国，砷矿广泛分布在我国的中南和西南的湖南、云南、广西、广东等省区，砷矿开采或冶炼，含砷农药、化肥等农资产品的过量投入等，可造土壤砷的累积，进而影响着植物、动物的生长和发育，且可以通过食物链进入人体，对人类的生存和健康构成威胁。

目前常用的砷污染土壤修复方法包括土壤改良剂法、客土法、化学冲洗法以及生物修复方法等。

生物修复方法是利用生物(主要是植物、微生物)的作用来消减、净化土壤中的砷或改变砷的结合形态和价态，被普遍认为是砷污染环境治理中最具应用前景的技术。其中，利用超富集植物去除土壤中砷的植物修复技术在最近几年中取得了突破性的进展，蜈蚣草(Brakefern，Pteris vitta)和大叶井口边草(Pteris nervosa)等砷超富集植物相继被发现，并可用于砷污染地区的土壤修复。在重金属污染土壤的生物修复技术中，除应用超富集植物吸收和富集重金属外，利用植物、微生物将土壤中的重金属转化为难溶态或气态化合物形式挥发到大气中，从而达到钝化甚至去除土壤中重金属的目的，也逐渐引起了人们的重视。如Terry等利用微生物和植物的作用，将环境中的硒(Se)转化为生物毒性较低的气态形式(二甲基硒和二甲基二硒)，将其直接或通过植物的组织挥发到大气中。Meagher等将细菌体内的汞(Hg)还原酶基因转入芥子科植物Arabidopsis后，得到的转基因植物能耐受、吸收土壤环境中的Hg，并将Hg²⁺还原成Hg⁰使其挥发进入大气。土壤中的砷化合物也可以转变为气态的甲基砷等物质，在多个圈层中迁移和转化。因此，利用某些微生物的对砷的富集、利用和转化等功能，将As累积到生物体内或使其转化为易挥发态的砷化合物，已成为潜在的As污染土壤修复技术之一。

目前，国内还没有对砷具有生物累积与挥发能力真菌的报道，国外的相关报道也屈指可数，且大多数还局限于实验室研究阶段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种棘孢木霉菌的筛选方法，将棘孢木霉菌应用于治理砷污染土壤以及减少砷在作物和农产品中的累积。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种棘孢木霉菌的筛选方法，包括：

采集砷污染土壤样品，在实验室内从该土壤样品中分离出真菌，将该真菌在不同砷浓度下培养，并观察菌落的生长状况及其对砷的耐性，由此筛选出棘孢木霉菌。

优选地，该方法具体包括：

将所述土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400～600mg/L的马丁培养基上分离出所述真菌；

将分离出的真菌经多次纯化、培养后，取直径为8～10mm的圆形真菌菌块或边长为8～10mm的方形真菌菌块，置于含砷1000mg/kg的PGP培养基上，比较菌落的生长状况，从中筛选出具有较高抗砷能力的棘孢木霉菌菌株。

优选地，马丁培养基的成分包括：葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、琼脂以及水，各成分的重量比为20∶10∶2∶1∶80∶4000；

PGP培养基的成分包括：马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为40∶4∶1∶400。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种棘孢木霉菌对砷的抗性的鉴定方法，包括：

在室内培养条件下测定棘孢木霉菌对砷的生物累积与挥发能力，以及在含有不同浓度砷溶液的培养条件下棘孢木霉菌生物量的变化，由此鉴定棘孢木霉菌对砷的抗性。

优选地，在室内培养条件下测定棘孢木霉菌对砷的生物累积与挥发能力，具体包括：