[发明专利]一种重组TAT-XIAP融合蛋白

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白转导结构域与优化的X-连锁凋亡抑制蛋白融合形成的融合蛋白。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是二十世纪八十年代以来发展起来的一项新技术，它主要是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。

传统的基因治疗是将目的基因导入到细胞当中，并使其表达，但是这一技术存在着以下一些不足：首先是常规转基因方法操作繁琐，转染效率较低，转染后目的基因表达水平不足，基因表达调控较困难，其次是常用的病毒载体存在着安全性的问题。

蛋白质转导是近年发展起来的一种将外源蛋白导入细胞的方法。将某些特殊的多肽与靶物质共价相连后，这些多肽会连同靶物质一起，进入临近细胞。这种由多肽携带靶物质跨过细胞膜的阻挡，进入细胞质的过程称为蛋白转导(protein transduction)。这些能携带外源物质进入细胞的多肽成称蛋白转导结构域(proteintransduction domain，PTD)。人类I型免疫缺陷病毒(HIV-1)的转录反式激活因子(trans-activator of transcription，TAT)的47～57位氨基酸(YGRKKRRQRRR)是转导功能较强而确切的一种蛋白转导结构域。研究表明，TAT-PTD能够将与之共价连接的生物大分子(如核酸、多肽、蛋白质等)转导入细胞内部，这种过程不依赖于受体和转运蛋白，能在无脂质体、磷酸钙、电转化、病毒载体等条件下直直接透过细胞膜甚至血脑屏障，并可在周围细胞间传递，被转导入细胞内的外源蛋白保留其原有的生物学活性与功能，与温度和能量无关，对宿主细胞几乎没有毒性。

在正常情况下，蛋白质由于分子量较大，是不能透过细胞膜阻挡，进入细胞质甚至细胞核中的，但是将富含赖氨酸、精氨酸的蛋白转导结构域多肤与共价的所需要的目的基因产物相连后，这些目的基因产物就会被带到细胞中，发挥应有的生物学功能。目前利用该方法已经高效地将EGFP、β-半乳糖苷酶、caspase-3、insulin等等多种蛋白质带到细胞中。目前最常用的蛋白转导结构域共价偶连方法是将目的基因与蛋白转导结构域基因相融合，最后产生赋予了新的转导能力的目的蛋白。

蛋白转导技术高效、快速，并且不受目的基因产物大小限制，因而有望成为一种新的基因治疗手段，目前正成为研究热点。

凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一类在结构上具有同源性的内源性凋亡抑制蛋白家族，对半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)诱发的细胞凋亡过程有明显的抑制效应。X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibotor ofapoptosis protein，XIAP)是IAP家族中最有效力的caspase抑制物，通过结合与抑制caspase-3、caspase-7、caspase-9的活性及减少细胞色素C从线粒体释放入胞浆而阻止细胞凋亡。

研究显示神经细胞凋亡是老年痴呆和帕金森病等神经退行性疾病的共同特征和结局。然而，XIAP是分子量57kDa的大分子物质，由于不易通过血脑屏障，使进一步研究和临床应用受到极大的限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种重组TAT-XIAP融合蛋白及其制备方法。所述的融合蛋白能够进入脑细胞中，产生抵抗细胞凋亡的作用。

本发明所述的重组TAT-XIAP融合蛋白，是人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域与优化的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列融合形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述重组TAT-XIAP融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述优化的X-连锁凋亡抑制蛋白是利用大肠杆菌偏爱密码子对核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列进行优化，该X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列从美国国立生物信息中心(NCBI基因库)获得，生物体为褐家鼠(Rattus norvegicus)，最早由日本的Saito，N获得。优化的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。