[发明专利]端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程的细胞修饰领域，涉及一种细胞系及其建立方法和应用，具体涉及一种端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下可生长、分裂，但经过有限次数的传代以后，就会停止增殖，进而衰老和死亡。这样限制了体外培养细胞的进一步应用。为了给细胞组织工程提供标准的细胞系，学者们提出了多种建立永生化细胞株的方法。所谓“永生化”(immortalization)，就是指细胞处于连续的细胞周期而终止其发育进程，使细胞获得了无限的增殖能力。建立永生化细胞至少具有以下几点优势：可以在体外研究软骨细胞的分化与生长及增殖之间的关系。永生化的组织细胞可以考虑作为组织细胞工程的细胞库或基因治疗的靶细胞，前者为组织组织工程提供大量的经过预先处理和优化的组织细胞，真正做到“组织工程化”；后者则使基因治疗应用于组织细胞成为可能，因为正常组织细胞传代、增殖有限的缺点妨碍了基因转染阳性靶细胞的挑选、鉴定及回输。另外可以作为药理或毒理研究的标准细胞，有利于对各项实验结果进行比较，因为各个实验室的组织细胞来源不同，培养方法各异，传代千差万别，使得实验结果难以比较。而采用永生化细胞使得实验采用的组织细胞保持统一。

细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite Cell Line)，也称连续细胞系(Continuous Cell Line)。建立永生化细胞系的方法包括肿瘤病毒、原癌基因、p53突变体等转染正常组织细胞来构建。肿瘤病毒包括腺病毒、猴肾细胞病毒、多瘤病毒等。其中猴肾细胞病毒转染比较常见。

猴肾细胞病毒(simian virus 40，SV40)，于60年代初被发现并分离，属多瘤病毒科，直径45nm，为20面体立体对称结构，壳粒数目为72，DNA分子量为3400kDa，由5,243个碱基对组成，它由结构蛋白(VP1、VP2、VP3)和两种肿瘤抗原(大T和小T抗原)组成。SV40病毒早期转录区转化基因(A基因)编码大T和小T抗原。大T抗原(95kDa)98％定位于细胞核内，具有ATP酶和DNA解旋酶活性，使蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化、ADP核糖基化和己酰基化以及活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，为细胞转化启动所必需，对转化起决定作用，而且转化细胞表型的维持必须有大T抗原的连续表达。小T抗原(20kDa)定位于核内及胞质内，能反式激活RNA多聚酶II和III基因的启动子，以及c-myc和c-fos癌基因转录，使细胞质肌动蛋白缺失和细胞粘附性下降，它不是细胞转化所必需的，但可起加强作用，与大T抗原一道共同维持转化表型。

SV40介导的永生化受多种因素影响，涉及到病毒DNA的整合、端粒酶的活化、生长抑制因子的失活等多个方面。研究证实，SV40的大T抗原能延长细胞寿命、使细胞永生化的功能与其灭活三种生长抑制因子-pRB、p53和SEN6的功能有关。①视网膜母细胞瘤基因产物(product of retinoblastoma gene，pRB)在脱磷酸化时，借助RB功能区与转录因子E2F形成稳定的复合物(pRB-E2F)，从而抑制E2F的转录活性，使细胞不能进入S期。而SV40大T抗原能与脱磷酸化的pRB结合形成复合物，而使E2F游离，促进细胞进入S期。②p53基因定位于17号染色体(17p13.1)，编码由393个氨基酸组成的核磷蛋白，具有转录因子作用。正常的p53蛋白(野生型)在细胞周期G1期停滞时，检查DNA的完整性，并通过其过度表达使受损细胞进入凋亡，以确保DNA复制的完整性，避免子细胞出现DNA丢失。SV40大T抗原能与p53结合而灭活其转录功能，使细胞避开G1期停滞，进入增殖。③6号染色体长臂存在生长抑制因子SEN6，定位于6q27，它与受体蛋白酪氨酸激酶EphB3相作用，SEN6功能的丢失将会导致永生化。SEN6在复制衰老和永生化中的具体作用尚不清楚，但推测可能与信号转导通路有关。近来研究发现永生化上调蛋白-1和永生化上调蛋白-2与SV40介导的永生化也密切相关。RyooZY等将IMUP-1和IMUP-2基因稳定转染到NIH/3T3小鼠成纤维细胞株后，发现IMUP-1和IMUP-2过表达的细胞株生长增殖特性发生改变，丧失停泊依赖生长特性，在裸鼠体内浸润生长并形成肿瘤，表明IMUP-1和IMUP-2的异位过表达在转化基因表型的获得、体外致瘤性中发挥重要作用。