[发明专利]一种水稻SNARE蛋白基因的抗病性基因工程应用

权利要求书

1.水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的基因工程应用，包括：

1)总RNA的提取

选用水稻抗稻瘟病品种“黑壳子粳”，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子 5×10⁴ml^-1接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱，取部分叶片， 用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，抽提总RNA， 电泳鉴定总RNA质量；

2)水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的克隆

设计两端引物：

P1：5-TTGCTTGCTTCCTCCCG-3，P2：5-TGTTTGATACGCTCTTGCTAA-3

将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶 进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min， 72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保温10min，末 端加A后克隆至pGEM-T载体，测序获得水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA 序列SEQ ID NO.1；

3)植物表达载体的构建

根据水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1，设计扩增出完 整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制性内切酶位点 Kpn I和Xba I，P3和P4引物序列为：

P3：5-AGGTACCATGAGCGTGATCGACAT-3，

P4：5-ATCTAGATCACTTTTTTAGAACATTG-3

以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsSYP71的cDNA 克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I和Xba I进一步将 OsSYP71克隆到双元表达载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框 架正确；

4)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1301转入农杆菌LBA4404，进一步转入水稻 感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR 验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢 子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比 具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。