[发明专利]1-O-乙酰大花旋覆花内酯提取物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种1-O-乙酰大花旋覆花内酯提取物的制备方法，具体涉及从 旋覆花组织培养物中提取及制备药用活性成分(1-O-Acetylbritanni lactone， ABL)的方法。

背景技术

最新药理学研究表明，菊科旋覆花属植物欧亚旋覆花(Inula britannica L.var. chinensis)的总提取物具有对外周和中枢神经的显著镇痛作用，低剂量时抑制炎 性疼痛，高剂量时既抑制炎性疼痛又可抑制神经疼痛。经分离得到的主要活性 成分之一为1-O-乙酰大花旋覆花内酯(1-O-Acetyl britanni lactone，ABL)。国外 亦有专利报道，ABL可通过诱导Bcl-2蛋白磷酸化而引发癌细胞编程性死亡， 具有和紫杉醇相似或更强的抗癌活性，可作为一种有效的天然化学防癌剂和治 疗药物，应用前景十分广泛。

目前，ABL的提取及制备主要来源于野生欧亚旋覆花的花序部位。在检测 中发现，该活性成分在野生植物中的含量极低且不稳定，并明显受到产地和生 长环境的影响，例如河北张家口山区的旋覆花花序中ABL含量为3.21mg/g，河 北平原一带仅为1.25mg/g；而采自湖北的旋覆花样品中根本不含有ABL。所以， 如果单纯依靠大量采集野生植物进行提取分离，不仅质量难以控制，产品得率 低，难以满足进一步的科研及临床需要，还会制约着进一步工业化大规模的提 取加工。

生物合成是通过对植物高产细胞、组织或器官的筛选与优化培养，将植物 体作为一个“药物加工厂”，在生物反应器内达到目标成分的高效产出，对于解 决中草药资源的可持续利用及天然药物的生产问题具有重要意义。因此，本发 明提供了一种以旋覆花不同组织培养物为生物合成载体对药用活性成分ABL进 行提取及制备的方法。

目前，有关ABL的研究主要集中在该化合物成分的提取、分离、纯化，以 及关于其药理活性作用的报道方面(专利CN1957939A公开了ABL用于预防和 治疗血管炎症性疾病的作用)。在《旋覆花组织培养及无性系建立的研究》文献 资料中，虽然报道了旋覆花愈伤组织、组培苗等培养物建立的方法，但尚未涉 及其它组培材料，如毛状根、悬浮细胞的培养等，尤其是针对组织培养物中活 性成分ABL的含量测定、提取和制备方法，以及通过生物反应器途径实现ABL 的工业化大规模生产，未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是建立旋覆花属植物完整系统的组织培养体 系，以及以这些培养物为生物合成载体进行ABL的提取、纯化和制备的方法。

本发明的技术方案包括如下步骤：

A、旋覆花无菌苗的培养：取旋覆花种子(优选来自于野生的旋覆花)，消毒 后培养获得无菌幼苗。

获得的无菌苗可以先接种于MS培养基中，生长几天后，再继代于 MS+0.5％(质量比)活性炭培养基中增殖培养。培养温度：23～27℃，湿度：60～ 70％，光强：28～32μmol/m².s，光照时间：13～15h/d；

B、悬浮细胞、愈伤组织、毛状根或黄化苗的获得：

①愈伤组织的获得：切取步骤A中培养的旋覆花无菌苗任一外植体材料， 划伤表面以形成伤口，接入MS+0.05-0.15mg/L CPPU+0.5-1.5mg/L 6-BA+0.2-1.0mg/L NAA培养基，黑暗或弱光条件下诱导愈伤组织的形成。

为了获得更为疏松、生长迅速的淡黄色愈伤组织团块，可将MS基本培养 基中NH₄NO₃和KNO₃的浓度均调整为2～5g/L，其它成分保持不变，即可获得 更为疏松、生长迅速的淡黄色愈伤组织团块；

②悬浮细胞的获得：将①中获得的疏松、生长迅速的淡黄色愈伤组织团块 培养于MS+0.05-0.15mg/L CPPU+0.5-1.5mg/L NAA固体培养基中，疏松愈伤组 织不断分离并继代，每隔20～40天继代一次，连续继代3～5次。

将生长旺盛、质地疏松的颗粒状白色愈伤组织，过细目筛获得单细胞或小 的细胞团，继代于液体培养基MS+0.05-0.15mg/L CPPU+0.5-1.5mg/L NAA中， 得到悬浮细胞系。每3～5周继代培养一次。温度：23～27℃，摇床转速：120～ 140r·min^-1，黑暗或弱光；