[发明专利]检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体地说，是一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用于快速检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

近年来，洛克沙砷因为具有刺激动物生长、抗寄生虫和较广的抗菌谱药理特性，被作为一种饲料饲料添加剂广泛应用于畜牧养殖业。

虽然洛克沙砷的毒性较低，但大剂量作用时，仍然会导致中毒，如引起维生素B1缺乏症、肌肉震颤、共济失调甚至死亡。另外还会对环境造成很大的污染，畜禽日粮中如果大量使用有机砷类制剂，其含砷的畜禽排泄物进入环境，使土壤、空气、水体遭受严重污染。为此，我国食品卫生及饲料卫生标准均对各种食品和饲料原料、产品中的洛克沙砷含量作了严格规定。如规定鸡蛋中的阿散酸(ASA)允许残留限量为0.5mg/kg。另外日本肯定列表也规定了各种禽肉产品中的洛克沙砷和硝苯砷酸的允许残留量为0.5mg/kg和2mg/kg。因此，对饲料中有机砷添加量进行控制具有重要意义。

目前检测洛克沙砷残留的方法主要为色谱分析法，如高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等。色谱技术对洛克沙砷检测是非常有效、准确的，但也存在如下缺点：(1)待测样品预处理程序繁琐费时；(2)需要经过专业培训的技术人员操作，操作人员要有丰富的相关经验，操作人员必须了解影响色谱分析的各种干扰因素，了解所使用方法的优缺点，才能获得可靠的分析结果；(3)需要昂贵的仪器设备辅助，难以在中小企业中普及；(4)仪器保养的要求高，保养的好坏直接影响分析结果的准确性；(5)检测费用高。

酶联免疫吸附法是以竞争性酶联反应为检测原理，以洛克沙砷抗体包被酶标板，检测时将被检样品和酶结合物同时加入酶标板，反应后通过显色测OD值来判定结果。存在的缺点是：(1)需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，不利于在基层单位进行推广使用；(2)检测操作人员需要经过专业培训；(3)操作过程相对比较复杂，检测所需时间比较长，全程需要2-4h。

胶体金免疫层析(gold-immunochromatography assay GICA)是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析方法，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测试纸条。

发明内容

本发明的目的主要是在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、操作简单、检测快速、准确的专门用于检测洛克沙砷的试纸条及其制备方法。

本发明的总体技术路线图见图1所示。

本发明是这样实现的：

为了实现本发明，申请人制备了一种能分泌抗洛克沙砷的单克隆抗体杂交瘤细胞系。

一种适用于检测洛克沙砷残留的试纸条，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有所述的抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有洛克沙砷-载体蛋白偶联物构成检测线(5)和兔抗鼠IgG构成质控线(6)。

一种适用于检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤包括：

1)将洛克沙砷与载体蛋白偶联，形成洛克沙砷-载体蛋白偶联物；

2)用洛克沙砷-载体蛋白偶联物(人血清白蛋白)免疫小鼠，分离脾细胞，体外进行细胞融合，筛选后得到分泌抗洛克沙砷的单克隆抗体的细胞系；

3)提取小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体；

4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

5)将步骤2)制备的抗洛克沙砷单克隆抗体加入步骤3)制备的胶体金中，得到抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物；

6)将抗洛克沙砷单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；

7)将洛克沙砷-载体蛋白偶联物(卵清蛋白)包被在硝酸纤维素膜(3)上构成检测线(5)；并将制备的兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(6)；

8)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测洛克沙砷残留的免疫胶体金试纸条。