[发明专利]一种促进10-羟基喜树碱生物合成的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及一种促进10-羟基喜树碱生物合成的方法。

背景技术

10-羟基喜树碱为我国特有珙桐科植物喜树(Camptotheca acuminala Decne)中含有的一种痕量生物碱，它以DNA拓扑异构酶I为作用靶点，通过抑制生物体DNA的合成而发挥抗肿瘤作用。它不仅本身是临床效果较好的抗肿瘤药物，而且还是制备拓普替康(Topotecan)和伊立替康(Irinotecan)等其它喜树碱类衍生物药品的重要中间体；它在临床上显示出广泛的抗肿瘤活性，并且毒副作用相对较小，国内的临床需求量和出口量逐年增加。长期以来我国企业一直是从喜树植物中直接提取，但因其含量低(约0.002％)，生产成本高，难以满足临床需要。因此，10-羟基喜树碱的制备研究愈来愈多地受到重视，它已成为除紫杉醇类以外的植物类抗肿瘤药物研究的第二大热点。目前，对10-羟基喜树碱的制备研究包括化学全合成、化学半合成、生物转化和在近缘植物中寻找新的药源等，但因种种原因，这些方法仍未用于工业化大生产。

发明内容

本发明人在开展悬浮培养喜树细胞制备10-羟基喜树碱的研究中，发现悬浮培养的喜树细胞通过添加某些外源性物质进行次生代谢调控和接种某些微生物进行生物转化后，喜树细胞培养物中10-羟基喜树碱的含量得到大幅度的提升。因此，针对提高10-羟基喜树碱得率的喜树细胞次生代谢调控方法和微生物转化方法等方面进行了系统的研究，为建立促进10-羟基喜树碱的生物合成方法及产业化奠定了基础。

本发明的目的在于提供一种促进10-羟基喜树碱生物合成的方法，通过添加外源性物质对悬浮培养喜树细胞的次生代谢进行调控和接种微生物对培养后期的喜树细胞进行生物转化从而提高10-羟基喜树碱的生产得率。

本发明采用的技术方案是：一种促进10-羟基喜树碱生物合成的方法，其特征在于该方法如下：

(1)喜树植物的叶在含激素的MS培养基上诱导愈伤组织；

(2)愈伤组织在含激素的MS培养基上继代培养以获得细胞培养系；

(3)喜树细胞悬浮培养使用的液体培养基为含激素的MS培养基；

(4)在喜树细胞悬浮培养液中加入硝酸钴2～200μMol/L、硝酸镧2～500μMol/L和水杨酸0.05～10mg/L；

(5)在喜树细胞培养后期接种刺囊毛霉(Mucor spinosus)和黑曲霉(Aspergillus.niger)进行生物转化；

(6)喜树细胞培养物与乙醇溶液进行匀浆处理并滤过，得到含有10-羟基喜树碱的滤液；

其中在步骤(1)、(2)、(3)中使用的激素为2，4-二氯苯氧乙酸和6-苄基腺嘌呤，它们联合使用，用量分别为0.1～2.5mg/L。具体地，其步骤如下：

1、喜树细胞培养系的建立：

A、外植体的获得：

取喜树植物的叶，使用清水清洁干净，浸入60～85％乙醇溶液中漂洗2～6min，然后用清水冲洗2～6次，再放置于滴加了2～10滴吐温-80的0.1～2％次氯酸钠溶液中浸泡1～30min；取出后使用无菌水冲洗至无泡沫，截成1～20mm长的小段。

B、喜树愈伤组织的诱导和继代培养：

喜树愈伤组织的诱导和继代培养是在光照培养箱中进行的。将A步获得的外植体接入固体培养基中，光照11～20小时/天，培养温度为20～35℃，培养11～30天，喜树愈伤组织每隔3～7周继代一次，继代2～6次。

作为诱导、继代培养喜树愈伤组织的固体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加了0.1～2.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2～40g/L蔗糖，0.2～10g/L尿素，0.2～1.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，凝固剂为琼脂0.1～6g/L，pH为4.5～7.5。

C、喜树细胞培养悬浮系建立：

将B步培养好的喜树愈伤组织转入通气量为0.1～0.8L/min的气升式内环流反应器中培养10～15天，温度为20～35℃。

进行悬浮培养的液体培养基，其基本培养基为MS培养基，其中附加0.1～2.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2～40g/L蔗糖，0.2～10g/L尿素，0.2～1.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，pH为4.5～7.5。

2、添加外源性物质进行悬浮培养喜树细胞次生代谢调控：