[发明专利]双表达G基因的重组狂犬病病毒的构建及其生物学特性分析

说明书

技术领域：

本发明属于重组疫苗领域。具体地，本发明提供一种重组狂犬病病毒 株，其在基因组中额外插入G基因；本发明提供构建所述重组狂犬病病毒 株的方法及其用于制备疫苗的应用。

背景技术

狂犬病是一种很重要的人畜共患病，每年约造成60,000人死亡⁽¹⁾。在 很多发展中国家，狗仍是造成人感染狂犬病的主要原因，而在发达国家， 狂犬病病毒主要存在于野生动物宿主。实践已证明，对动物如狗进行免疫 能显著降低人狂犬病的发病率⁽²⁾，因此对动物实施免疫对控制狂犬病极为 重要。

狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，基因组是不分节段的单股负链 RNA，全长约12kb，编码5种病毒蛋白：核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白 M、糖蛋白G和RNA聚合酶L。位于囊膜上的糖蛋白G是主要的致病因子， 同时也是诱导保护性免疫反应的主要抗原。

目前，在我国Flury-LEP活毒疫苗被广泛使用于对狗的免疫。该病毒是 由Koprowski等于1940年从狂犬病致死的一个女孩脑内分离到1株强毒Flury 株连续在1日龄雏鸡脑内通过138代，再经鸡胚卵黄囊传40～50代，降低了 其周围注射时侵犯中枢神经系统的特性。该病毒对狗不致病，但保持其免疫 原性，但是小鼠脑内注射时仍感染并致死，且Flury-LEP疫苗有时能够在3 月龄幼犬引起狂犬病。鉴于弱毒活疫苗在使用过程中存在较大的安全隐患， WHO建议使用狂犬病灭活疫苗代替弱毒疫苗。

为获得高效的、免疫原性更佳的狂犬疫苗株，本研究利用反向遗传技 术构建了一个含有2个G基因的狂犬病病毒rLEP-G。我们鉴定了该重组 病毒株的生物学特性，并将其与野生型毒株Flury-LEP进行了比较。结果 表明重组病毒rLEP-G与LEP相比具有更好的安全性和免疫原性，适用于 狂犬病毒灭活疫苗的开发。

发明内容

针对本发明待解决的技术问题，本发明在第一个方面中提供一种具有 更好的安全性和免疫原性的重组狂犬病病毒株，其在基因组中额外插入G 基因。

在第一个方面的一个实施方案中，包含两个G基因的基因组如图1 所示，其在Pme I酶切位点插入另外一个G基因，插入G基因后的狂犬病 重组病毒基因组如图1A所显示。在第一个方面的一个实施方案中，所述 重组病毒是由野生型狂犬病病毒株Flury-LEP构建而来。在第一个方面的 一个实施方案中，所述构建的重组狂犬病毒株是如本发明实施例构建的 rLEP-G。在一个实施方案中，所述插入的G基因的序列如SEQ ID NO：8 所示。

在本发明的第二个方面中，提供构建所述重组狂犬病病毒株的方法， 所述方法包括下列步骤；

1)构建转录质粒，其中将G基因序列插入野生型狂犬病病毒株的基 因组中，得到含有双G基因的重组基因组全长cDNA克隆；

2)构建辅助质粒系统，所述辅助质粒系统分别编码LEP的核蛋白N、 磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L；

3)使用含有双G基因的重组基因组全长cDNA克隆的质粒载体以及 辅助质粒系统共转染到容许所述病毒复制的宿主细胞，培养所述宿主细 胞；

4)拯救病毒。

在第二个方面的一个实施方案中，构建的转录质粒为pCI-LEP-G，构 建的转录辅助质粒分别为pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L。在第二个方 面的一个实施方案中，所用的宿主细胞为BHK-21细胞。

在本发明的第三个方面中，提供包含如第一方面中所构建的含有双G 基因的重组基因组全长cDNA克隆的质粒载体。在第三个方面的一个实施 方案中，所述质粒载体为pCI。

在本发明的第四个方面中，提供在第一个方面中构建的重组病毒株用 于制备狂犬病病毒灭活疫苗的应用。

发明效果

由本发明提供的包含两个G基因的重组狂犬病病毒株rLEP-G株在神 经细胞NA细胞和非神经细胞BHK-21细胞上的生长动力学曲线与亲本 Flury-LEP株十分相似，并且对比格犬的免疫试验还表明，灭活的重组病 毒rLEP-G可诱导比野生型狂犬病毒毒株更高的中和抗体水平，说明可以 将本发明的重组狂犬病病毒株用于开发更安全和更具免疫原性的疫苗。

附图说明

图1(A)双G基因的LEP基因组的构建