[发明专利]用于在平面基底上进行细胞附着和培养的方法和组合物

说明书

本发明要求于2008年11月20日提交的序列号为61/116,452的专利申请的优先权。

技术领域

本发明涉及使多能干细胞在缺少吸附层和饲养细胞层的平面基底上生长、扩增和分化的方法。

背景技术

哺乳动物细胞培养是生命与健康科学中许多方法之一。涉及贴壁依赖性细胞的哺乳动物细胞培养和分析用容器通常由玻璃或聚合物(例如聚苯乙烯)制成，其经常需要额外的表面处理以使得细胞能贴附至容器表面。这样的处理可包括在表面施加吸附层，例如，通过吸附、接枝或等离子体聚合技术施加。作为另外一种选择，表面处理可借助于容器表面自身的化学改性，其可通过(例如)大气华、射频真空等离子体、直流辉光放电和微波等离子体处理等实现。

目前培养多能干细胞、尤其是胚胎干(ES)细胞的方法要求复杂的培养条件，例如，在具有饲养细胞层的固体基底表面上或在具有胞外基质蛋白的吸附层的固体基底表面上培养胚胎干细胞。采用这些方法的培养体系通常使用饲养细胞或胞外基质蛋白，这些饲养细胞或胞外基质蛋白取自与培养中的干细胞的物种不同的物种(异种材料)。可将通过暴露于饲养细胞获得的培养基(即经未分化的ES细胞之外的细胞调理过的培养基)用于培养ES细胞，并且可在培养基中补充动物血清。

例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnol.18：399-404，2000)和Thompson等人(Science 282：1145-1147，1998)公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养取自人胚泡的ES细胞系。

又如，Xu等人(Nature Biotechnology 19：971-974，2001)公开了使用MATRIGEL和层粘连蛋白处理固体基底表面，然后在不发生分化的情况下对人ES细胞进行无饲养细胞培养。又如，Vallier等人(J.Cell Sci.118：4495-4509，2005)公开了使用胎牛血清处理固体基底表面，然后在无分化的情况下对人ES细胞培养进行无饲养细胞培养。

又如，WO2005014799公开了一种用于哺乳动物细胞的维持、增殖和分化的调理过的培养基。WO2005014799声称“通过鼠细胞、尤其是那些分化的和永生化的转基因肝细胞(称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性调理根据本发明制备的培养基”。

又如，Wanatabe等人(Nature Biotechnol.35：681-686，2007)声称“ROCK抑制剂使得分离的人胚胎干细胞能成活”，并且证实减少了解离诱导的细胞凋亡，增加了克隆效率(从大约1％增加到大约27％)和基因转移后的亚克隆的便捷性，该方法使用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，使用胶原和MATRIGEL作为胞外基质蛋白，使用Y-27632或法舒地尔(Fasudil)抑制ROCK。此外，用Y-27632处理过的解离的人ES细胞可避免在无血清悬浮培养中发生凋亡。

又如，Peerani等人(EMBO Journal 26：4744-4755，2007)描述“人胚胎干细胞(hESC)培养物中的空间组织的复杂性产生影响hESC命运的异质微环境(小生境(niche))。本研究证实可通过改造hESC小生境特性来控制hESC的分化速率和分化轨迹。小生境的大小和组成可调节分化诱导因子和抑制因子之间的平衡。从机制上来讲，Smad1信号传导的小生境大小依赖空间梯度是由于hESC和hESC来源的胚外内胚层(ExE)之间的拮抗相互作用产生。这些相互作用由骨形态发生蛋白2(BMP2)的ExE定位分泌及其拮抗剂生长分化因子3(GDF3)的hESC定位分泌介导。对用GDF3、BMP2和Smad1的小干扰RNA(siRNA)以及Rho相关激酶(ROCK)抑制剂处理过的hESC进行微图型化证明，对Smad1激活的独立控制可挽救hESC的集落大小依赖性分化。我们的结果首次阐明了Smad1在空间信息的空间整合和hESC自我更新和分化的小生境大小依赖性控制中的作用”。